一种来自人类皮肤、能够感染凝固酶阴性葡萄球菌的噬菌体

摘要：人体皮肤微生物由不同种群组成，这些种群在身体部位和个体之间存在时间性差异。葡萄球菌是在皮肤最常见的细菌之一。本文报道了从感染凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)的人类皮肤拭子中分离和测序的40个噬菌体，扩展了我们对噬菌体多样性的认识。鉴定了六个噬菌体遗传簇，其中两个簇代表新的噬菌体，其中一个表征命名为Alsa噬菌体。对葡萄球菌噬菌体的研究能够了解它们对皮肤微生物组进一步研究的贡献以及限制噬菌体感染的机制。

一、从人体皮肤中分离和鉴定CoNS感染噬菌体

由健康志愿者（n = 80）获取320个皮肤样本，通过分离纯化，得到40个噬菌体。使用ONT对纯化的噬菌体基因组DNA进行测序，以深入了解噬菌体多样性，并基于与1332个噬菌体参考基因组序列相比的全基因组序列相似性构建系统发育树。这些噬菌体被分为6个基因簇，其中两个是新的。基于ICTV命名法，每个噬菌体都属于Caudoviricetes类的未定义目。两个新的噬菌体基因簇被分配为Siphoviridae家族的未分类成员（簇4）和一个未定义的Herelleviridae家族（簇1）。簇1经过vConTACT比对形成了自己的亚簇Alsa。

图1 CoNS噬菌体的系统发育树和关系

利用VirClust蛋白存在/缺失分层聚类计算基因组间距离，进一步区分40个噬菌体基因组。VirClust分析强调了层次树中4个分支的不同蛋白质含量，显示了所属噬菌体簇之间有限的蛋白质重叠。除了Alsa噬菌体的区别之外，基因组间相似性分析得出的簇4的dsDNA噬菌体(S-CoN_Ph26)基因组包含独特的编码蛋白质簇，支持它作为一种新的噬菌体。对6个簇中每个簇代表性噬菌体进行形态学分析。噬菌体S-CoN_Ph26(第4簇)具有短而不收缩的尾部，而其余的噬菌体簇代表都是长尾噬菌体。基于Pharokka注释，在噬菌体中既没有鉴定出毒力相关基因，也没有鉴定出CRISPR-Cas。

图2 CoNS噬菌体基因组的分层聚类

四个Alsa噬菌体基因组的结构显示出与配置功能蛋白和结构蛋白的同源性。tRNAscan-SE未检测到tRNA编码序列，phageTerm检测到长度为8250 ~ 9667 bp的DTR (Direct Terminal Repeat)序列。具有内溶素活性的Alsa噬菌体的裂解基因分别编码三种具有细胞壁裂解功能的蛋白质：CHAP结构域蛋白，肽聚糖识别蛋白（PGRP）和β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶。噬菌体Alsa基因组还编码一种假定的裂解性转糖基化酶结构域蛋白，其基因位于尾纤维基因的远端。在本研究的其他噬菌体基因组中未发现裂解转糖基酶结构域。Alsa噬菌体还具有一个Ig结构域蛋白，其作用不详。与Alsa_1和_2噬菌体相比，Alsa_3和_4噬菌体中增加了一个尾部基因。

图3 基于功能注释的Alsa噬菌体编码区比较

二、新型Alsa噬菌体的表征

一步生长曲线法表明øAlsa_1和øAlsa_2潜伏期为15 min，而øAlsa_3和øAlsa_4潜伏期分别为20 min和30 min，爆发量从9~590 PFU不等。øAlsa_1和øAlsa_2在50℃时稳定性较好，而øAlsa_3和øAlsa_4在50℃时稳定性较差。只有øAlsa_1和øAlsa_4在−20℃下具有稳定性。四种噬菌体在pH4~9范围内均保持稳定。

图4 Alsa噬菌体的一般特征

在不同MOI(0.01、0.1和1)条件下，测定Alsa噬菌体在原宿主菌株中对宿主培养生长的影响。当MOI为1时，20小时后几乎完全裂解，在MOI为0.1时，øAlsa_4没有完全裂解，而当MOI为0.01时，四个噬菌体在各自的宿主中都有不同程度的裂解。

图5 Alsa噬菌体的生长动力学

使用了8种葡萄球菌的140株菌株比较40种皮肤分离噬菌体的宿主范围。Alsa噬菌体显示出完全裂解人链球菌的能力。其中，øAlsa_1、øAlsa_2、øAlsa_3和øAlsa_4分别感染了140株葡萄球菌的9%、8%、5%和3%，而人链球菌(n = 26)的感染率分别为50%、42%、15%和27%。为了深入了解潜在的防御机制，解释观察到的人类链球菌有限噬菌体感染，使用PADLOC和DefenseFinder对所有测试菌株(n = 26)的基因组进行了探究。多重流产感染(Abi)防御和RM系统广泛存在于用于宿主范围分析的菌株中。值得注意的是，RM IV型在每个人猿基因组中都被鉴定出来，每个基因组附近都有一个编码5-甲基胞嘧啶特异性限制性内切酶系统保守结构域蛋白(McrC；序列同一性65-100%)。为了确定IV型RM是否在人猿中广泛存在，分析了NCBI数据库中可用的243个基因组，结果揭示了Abi和Gabija系统的存在，以及RM I型和IV型防御系统的高频存在。

为了研究噬菌体感染的宿主范围是否与噬菌体的存在和观察到的噬菌体耐药性相对应，对用噬菌体测试的人链球菌分离物进行比较基因组分析，发现完整的噬菌体数量从0到1不等，另外还有不完整的噬菌体区域(图8)，显示了溶源噬菌体感染的证据。此外，当比较来自宿主范围分析的猪头链球菌和表皮链球菌的基因组时，前噬菌体数量与感染抗性之间没有相关性。这表明，本研究中观察到的人类链球菌噬菌体感染屏障可能是一种由种特异性不完全前噬菌体决定的重复感染机制，但尚未进一步研究。在每个宿主菌株中也测定了质粒含量，没有发现存在的质粒数量与噬菌体感染易感性之间的明确联系。

图6 噬菌体防御系统和原始链球菌的质粒含量

总之，本研究中对葡萄球菌感染噬菌体的广泛收集，增加了改进CoN重组DNA研究所需的分子工具包的潜力，该研究落后于金黄色葡萄球菌的研究。此外，研究噬菌体在减少葡萄球菌生物膜以及治疗和个人护理应用中的应用可以在未来进一步研究。

参考文献:Alsaadi, S.E., Lu, H., Zhang, M. et al. Bacteriophages from human skin infecting coagulase-negative Staphylococcus: diversity, novelty and host resistance. Sci Rep 14, 8245 (2024). https://doi.org/10.1038/s41598-024-59065-9