“压力”变动力！解脂耶罗酵母如何突破琥珀酸生产极限？

琥珀酸（Succinic acid）是一种重要的生物基C4平台化学品，再化工、医药、食品和环保等多个领域具有广泛的应用。在传统琥珀酸生产中，微生物发酵法因其环境友好、成本低廉等优点成为主流技术。然而，发酵过程中存在诸多挑战，如发酵得率低、副产物复杂和细胞耐受性差等。特别是酸性环境对微生物细胞的生长和代谢活动产生显著抑制，限制了琥珀酸的高效生产。非传统酵母菌——解脂耶罗酵母（Yarrowia lipolytica）因其独特的代谢能力、对低pH环境的强耐受性以及安全性较高，成为生产琥珀酸的有力细胞工厂。然而，在酸性条件下，琥珀酸的高浓度积累会对微生物细胞产生显著的胁迫，导致细胞活力下降、代谢活动受损，最终影响琥珀酸的生产性能。因此，如何通过改造解脂耶罗酵母，提升其在酸性环境中的琥珀酸产量和细胞代谢活力，成为当前研究的重要方向。这不仅有助于提高琥珀酸的生产效率，还能为其他生物基化学品的生产提供宝贵经验。

近日，上海交通大学李凯/赵心清团队在ACS Sustainable Chemistry & Engineering（IF：7.1）发表题为“Leveraging stress tolerance property to enhance succinic acid production and cell metabolic activity of Yarrowia lipolytica”的研究性文章，旨在通过过表达YALI0_A07997g和优化补料分批发酵来增强解脂耶氏酵母中琥珀酸的产生和细胞代谢活性。

图1 文献基本信息

高浓度的琥珀酸对生产菌株会产生一定的毒性，从而影响菌株的生长和琥珀酸的合成。基于此，作者首先在琥珀酸存在和低pH胁迫条件下评估解脂耶氏酵母的生长状况，结果表明，解脂耶氏酵母在40 g/L浓度的琥珀酸胁迫条件下表现出显著的抑制作用。因此，作者选择选择40 g/L浓度的琥珀酸用于后续实验，以进一步研究琥珀酸应激下的整体基因转录。此外，与相同pH值为40 g/L琥珀酸（pH 3.08）而不添加琥珀酸的胁迫相比，琥珀酸引起的生长抑制更为明显。这表琥珀酸对解脂耶氏酵母的有害影响不仅归因于与琥珀酸相关的pH值变化，还归因于琥珀酸对酵母生长的直接影响。

图2 解脂耶氏酵母菌株在不同琥珀酸浓度下的生长性能

为阐明琥珀酸胁迫下与解脂耶氏酵母生长抑制相关的代谢变化，作者比较了40 g/L琥珀酸胁迫和非胁迫条件下解脂耶氏酵母pfo1的葡萄糖摄取、利用和主要代谢变化。作者发现与脂质代谢相关的生物过程显著下调，而与代谢过程、氧化还原过程相关的基因则显著上调。这表明琥珀酸胁迫不仅影响了酵母的脂质代谢和膜功能，还诱导了细胞的抗氧化机制。

图3 琥珀酸胁迫下解脂耶氏酵母的代谢变化

为了确定提高琥珀酸耐受性的潜在靶点，作者对解脂耶氏酵母po1f 菌株在 40 g/L 琥珀酸胁迫下对数生长期间以及低pH（pH 3.08）胁迫期间与非胁迫条件进行比较。作者筛选出10个与琥珀酸耐受性相关的基因。其中，过表达 YALI0_A07997g基因在提升解脂耶氏酵母的琥珀酸耐受性方面效果显著。尽管 YALI0_A07997g 基因的功能尚不清楚，但研究证实其在提升琥珀酸耐受性方面具有重要作用。

图4 琥珀酸应急下转录上调和下调基因的GO分析

图5 在40 g/L琥珀酸胁迫下过表达耐受基因的菌株生长情况

在获得耐受性菌株的基础上，作者进一步通过敲除琥珀酸脱氢酶基因SDH5并过表达YALI0_A07997g基因，成功构建了琥珀酸高产重组菌株解脂耶氏酵母 ΔSDH5-A11菌株。SDH5基因的敲除导致琥珀酸积累，而YALI0_A07997g基因的过表达则增强了细胞的琥珀酸耐受性。该菌株在5L发酵罐中实现了88.5 g/L的琥珀酸产量，生产强度高达1.23 g/L/h。通过比较耐受菌株与原始菌株的呼吸商和关键基因表达谱，研究发现耐受菌株在琥珀酸合成过程中呼吸熵显著降低。通过比较ΔSDH5-A11菌株和亲本菌株在补料发酵过程中的转录组，研究者们发现了一些与转运蛋白、应激相关基因和转录因子相关的基因表达变化，这些变化可能与ΔSDH5-A11菌株在高琥珀酸积累条件下的优良性能有关。

图6 使用解脂耶氏酵母ΔSDH5（A）和解脂耶氏酵母ΔSDH5-A11（B）菌株通过甘油进行琥珀酸生产的补料批培养

图7 解脂耶氏酵母R2ΔSDH5和ΔSDH5-A11发酵过程中耗氧率（OUR）、产二氧化碳率（CER）和呼吸商（RQ）的时间变化曲线

图8 酵过程中与转运、应激耐受性和转录因子相关的基因转录变化，分别在发酵的12小时、36小时和84小时进行检测

本研究旨在通过提高解脂耶氏酵母的抗逆性来提高琥珀酸的产生。关键策略包括缺失SDH5、过表达YALI0_A07997g基因以增强琥珀酸耐受性以及控制DO 水平以减少副产物形成。在优化条件下，工程菌株的琥珀酸浓度达到88.5 g/L，生产速率为1.23 g/L/h。该研究结果表明，可以通过提高琥珀酸耐受性相关的新基因来实现高效的琥珀酸生产。此外，该研究中确定的与解脂耶氏酵母中的琥珀酸和低pH耐受性相关的其他关键基因将有助于开发用于可持续生产的健壮菌株。

该研究为工业规模琥珀酸发酵生产提供了极具潜力的解脂耶罗酵母菌株，有望降低工业发酵成本。同时，其采用的ALE策略和代谢途径优化方法，也为其他微生物细胞工厂的改造提供了有益的借鉴，有助于提高微生物在生产过程中的耐受性和生产效率。未来，随着对微生物代谢机制的深入研究和更多工程策略的开发，有望进一步提升琥珀酸及其他生物基化学品的生产水平。

参考文献：Meng-Lin Sun, Donglai Fang, Duwen Zeng, et al. Leveraging stress tolerance property to enhance succinic acid production and cell metabolic activity of Yarrowia lipolytica. ACS Sustainable Chemistry & Engineering. 2025 13 (14), 5210-5219. DOI: 10.1021/acssuschemeng.4c10404