2021年2月5日，路易斯维尔大学肝生物学与毒理学中心Wenke Feng团队在期刊《Hepatol Communication》上在线发表题为“Exosome-Like Nanoparticles From Lactobacillus rhamnosus GG Protect Against Alcohol-Associated Liver Disease Through Intestinal Aryl Hydrocarbon Receptor in Mice” 的研究性文章。通过实验证明了益生菌鼠李糖乳杆菌GG (LGG)通过增强肠道屏障功能对实验性ALD的保护作用。这项研究发现， LGG释放的外泌体样纳米颗粒(ELNPs) 通过肠道AhR-Nrf2信号通路增加抗菌肽(Reg3γ和Reg3β)和紧密连接蛋白的表达，从而减少细菌易位和内毒素血症，从而保护酒精暴露诱导的脂肪肝和损伤。研究结果表明，益生菌及其上清的有益作用可能是由益生菌释放的外泌体样NPs介导的。这些发现可能会导致治疗ALD和其他肠道屏障功能障碍相关疾病的策略

酒精使用障碍引起的慢性肝病显著增加了全球疾病负担和死亡率。酒精性肝炎是一种严重且危及生命的酒精相关肝脏疾病。肠道微生物群在小鼠中促进乙醇诱导的肝脏疾病，但对负责这一过程的微生物因素知之甚少。本研究发现，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)分泌的一种双亚基外毒素溶胞素是导致肝细胞死亡和肝损伤的原因。

1. LGG产生类似外泌体的纳米颗粒

LDNPs是细菌培养物超离心分离物，其组学分析鉴定出60种蛋白质，包括代谢、细胞壁成分/肽聚糖重塑、转运蛋白、核糖体结构成分、核酸结合蛋白、噬菌体相关蛋白和氨基酶，其中p75和p40在LDNPs中大量存在。用荧光染料标记LDNPs并灌胃给药显示，LDNPs大量定位于肠绒毛、回肠固有层和肠系膜脂肪组织，但很少定位于肝脏；用标记的LDNPs孵育巨噬细胞RAW264.7细胞和小鼠肝细胞，巨噬细胞中发现阳性LDNPs，而肝细胞中未发现阳性LDNPs，表明口服给药后，LDNPs主要被肠道免疫细胞和上皮细胞吸收。

2. LDNPs抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症

用LDNPs预处理RAW264.7细胞、腹膜巨噬细胞(pm)和骨髓源性巨噬细胞(bmdm)，然后用LPS刺激。LPS显著上调Tnf-α的mRNA表达。与RAW264.7细胞的结果一致，LDNPs显著降低了PM和BMDM中Tnf-α和IL-1β的mRNA的表达。

3. LDNPs增加AhR基因的活性

利用LC-MS代谢组学分析LDNPs的代谢物组成，发现了超过2000种代谢物。色氨酸衍生的AhR配体在LDNP货物中大量存在。荧光素酶报告分析显示，LDNPs和LGGs均能增加AhR活性。然而，当LGGs中LDNPs被耗尽时，AhR报告细胞活性的诱导显著降低，LGGs中吲哚丙烯酸(IA)和吲哚-3-醛(I3A)的浓度显著降低。综上所述，这些数据表明LDNP在细菌色氨酸代谢的AhR配体中富集。

4. LDNPs增加肠道AhR下游信号传导

回肠固有层淋巴细胞(LPLs)与LDNPs的孵化能显著诱导细胞色素Cyp1a1和IL-22的mRNA表达，这是核受体AhR的两个转录靶点。重要的是，LDNPs对Cyp1a1和IL-22表达的影响被AhR抑制剂CH223191完全抑制。此外，发现LDNPs使培养基中IL-22的蛋白水平提高了约5倍，而CH223191完全抑制了IL-22的上调。给小鼠灌胃，发现LDNPs显著增加了回肠中Il-22和Cyp1a1 mRNA的表达，但在结肠中没有。LDNP显著增加了IL-22介导的回肠Reg3b和Reg3g mRNA的表达。

5. LDNPs增加肠紧密连接蛋白的表达

LDNP处理显著增加了Caco-2细胞中的三种主要紧密连接蛋白，ZO-1、occludin和claudin-1。发现I3A显著增加Cyp1a1 mRNA表达和Cyp1a1活性，Cyp1a1活性被CH223191阻断，提示AhR调控。与I3A类似，LDNPs诱导Cyp1a1 mRNA表达显著上调，Cyp1a1活性增加，被CH223191阻断，表明LDNPs具有AhR依赖性作用。I3A和LDNPs都增加了紧密连接蛋白的表达，该蛋白被CH223191抑制。表明LDNPs具有AhR激动剂样活性，并且LDNPs上调肠上皮细胞紧密连接是AhR依赖性的。LDNP处理显著增加了Caco-2细胞中Nrf2 mRNA和蛋白水平的表达，而这种上调被Nrf2抑制剂ML385完全抑制。LDNPs诱导的Nrf2表达也被CH223191阻断，这表明LDNPs上调Nrf2需要AhR。

6. LDNPs可以预防ALD

小鼠连续10天饲喂含5% EtOH (vol/vol)的Lieber DeCarli日粮，最后一天在献祭前9小时灌胃EtOH (10d+1b)。最后3天，以50 μg/只灌胃LDNPs，每天1次。研究显示，酒精喂养增加了肝脏脂肪堆积，LDNP处理显著降低了肝脏脂肪堆积。ALT和AST水平在酒精作用下升高，在LDNP作用下降低。通过标记实验证实LDNP处理可防止酒精引起的凋亡细胞死亡。通过肝脏促炎介质Tnf-α和Il-1β的mRNA表达可见，LDNPs治疗显著减轻了酒精喂养引起的肝脏炎症。

7. LDNPs增加肠道AhR活性，减少肝脏细菌转移

酒精喂养显著降低了肠道Cyp1a1 mRNA表达和Cyp1a1活性，表明酒精减弱了AhR的激活。LDNP处理显著增加了PF和AF条件下小鼠Cyp1a1 mRNA的表达和活性。酒精显著降低了回肠IL-22 mRNA和血清蛋白水平。LDNP处理显著增加了回肠IL-22的表达。没有观察到酒精或LDNPs对肝组织中Il-22和Cyp1a1 mRNA表达的任何影响，表明对AhR通路的影响可能是肠道特异性的。酒精分别轻微或显著降低了回肠Reg3b和Reg3g的mRNA水平。LDNP处理增加了PF和AF条件下Reg3b和Reg3g mRNA的表达。此外，回肠组织溶菌酶染色显示Paneth细胞数量减少， LDNPs处理后Paneth细胞数量增加。Reg3β和Reg3γ的升高会减少细菌易位。综上所述，研究结果表明，LDNPs增加了肠道AhR-IL-22-Reg3信号通路，导致酒精喂养小鼠肝脏中细菌易位减少。

8. LDNP治疗通过Nrf2激活降低循环内毒素水平

AF显著降低回肠核Nrf2蛋白水平，轻微降低Nrf2 mRNA表达。LDNP处理增加了PF小鼠肠道Nrf2的表达，阻止了AF小鼠肠道Nrf2的表达减少。AF显著降低肠道NAD(P)H:醌受体氧化还原酶1 (Nqo1) mRNA表达。LDNP处理显著增加了PF小鼠Nqo1 mRNA的表达，阻止了AF小鼠Nqo1 mRNA的表达减少。回肠组织染色显示AF增加ROS, LDNP处理显著降低ROS。AF降低了回肠ZO-1、occludin和claudin-1的蛋白表达。LDNP处理阻止了这些蛋白的下调。房颤使血清LPS水平升高，而LDNP处理可抑制血清LPS水平。综上所述， LDNPs通过上调Nrf2表达抑制酒精暴露诱导的氧化应激，从而改善肠道屏障功能。

9. LDNPs的作用受AhR信号通路的调控

LDNP处理后，减少了CH223191，用抑制剂灌胃LDNP后，没有发现变化。与IL-22的调控类似， LDNPs增加Reg3g mRNA的表达，并被CH223191阻断。结果，由肝脏细菌负荷决定的细菌易位被抑制剂显著增加，并且当抑制剂被共同施用时，LDNPs的作用被阻断。此外， AhR抑制剂降低了AF小鼠回肠Nrf2和Nqo1 mRNA的表达，并且当与CH223191一起使用时，LDNPs不能增加这些抗氧化分子的表达。表明，LDNPs对酒精诱导的细菌易位进入肝脏的预防作用是由AhR调控的信号通路介导的。

参考资料：鼠李糖乳杆菌外泌体样纳米颗粒通过肠道芳烃受体预防小鼠酒精相关肝病