艰难梭菌是医院获得性腹泻和结肠炎（CDAD）的主要致病菌，其毒素可诱导结肠上皮细胞释放 IL-8 等炎症因子，引发中性粒细胞大量浸润，导致肠道损伤。现有抗生素治疗 CDAD 复发率高，因此需探索益生菌等新干预手段。本研究旨在从婴儿粪便来源的乳酸菌中筛选能抑制艰难梭菌诱导 IL-8 产生的菌株，并探究其机制。

研究人员对 34 株婴儿粪便来源的乳酸菌进行筛选，通过检测其条件培养基（LCM）对艰难梭菌刺激的 HT-29 结肠上皮细胞 IL-8 分泌的影响，发现 3 株菌（鼠李糖乳杆菌 L34、鼠李糖乳杆菌 L35、干酪乳杆菌 L39）的 LCM 能使 IL-8 分泌量减少 50% 以上（图 1A）。进一步分析显示，L34 与 L35 因基因高度同源（来自同一宿主，核苷酸序列几乎一致），后续实验仅保留 L34 和 L39。此外，这两株菌的 LCM 单独与 HT-29 细胞共培养时，不会诱导 IL-8 产生，表明其作用具有特异性。

多因子检测显示，艰难梭菌除诱导 IL-8 外，还会刺激 HT-29 细胞产生 GM-CSF（一种促进中性粒细胞存活和增强其对 IL-8 趋化反应的炎症因子）；而 L34 和 L39 的 LCM 可显著降低 GM-CSF 的产生（图 1B），另一株鼠李糖乳杆菌 L31 的 LCM 则无此作用。药敏实验表明，L34 和 L39 对万古霉素和甲硝唑均具有耐药性（MIC>256 μg/mL），这一特性使其可与抗生素联合使用。细胞活力检测（台盼蓝排斥法）显示，两种 LCM 对 HT-29 和 Caco-2 结肠上皮细胞的活力无影响（存活率 > 90%）。同时，LCM 不影响艰难梭菌的活力（菌落计数无显著差异）及毒素 A、B 的产生（细胞内外毒素浓度与对照组无差异）。定量 RT-PCR 结果显示，L34 和 L39 的 LCM 处理 4 小时后，艰难梭菌刺激的 HT-29 细胞中 IL-8 mRNA 水平较对照组下调约 0.5 倍（p<0.001，图 2），表明其抑制作用发生在转录水平。

IL-8 的转录受 NF-κB 和 AP-1（由 c-Jun 等组成）调控，二者的激活依赖于 p65 和 c-Jun 的磷酸化。Western blot 分析显示：L34 的 LCM 在 30 分钟时使磷酸化 NF-κB（p-NF-κB）水平降低 47.93%（p<0.001），但对磷酸化 c-Jun（p-c-Jun）无影响（图 3A、3B）；L39 的 LCM 在 15 分钟时使 p-NF-κB 降低 18.62%（p<0.01）、p-c-Jun 降低 38.19%（p<0.01），30 分钟时 p-NF-κB 进一步降低 43.19%（图 3A、3B）。

热稳定性实验显示，L34 和 L39 的 LCM 经 100°C 处理 15 分钟、30 分钟或 1 小时后，仍能抑制 IL-8 分泌，表明其抗炎因子具有热稳定性。尺寸分级实验（使用 30 kDa 和 100 kDa 离心过滤器）显示，>100 kDa 的组分保留 IL-8 抑制活性，而 <30 kDa 和 30-100 kDa 组分无活性（图 4B），提示抗炎因子分子量> 100 kDa。

本研究首次发现鼠李糖乳杆菌 L34 和干酪乳杆菌 L39 可通过分泌热稳定、大分子量（>100 kDa）的因子，特异性抑制艰难梭菌诱导的炎症反应，且不影响致病菌的生长和毒素产生。其作用机制依赖于对 NF-κB 和 c-Jun 信号通路的精准调控，为 CDAD 的益生菌干预提供了新靶点。由于这两种菌株具有万古霉素耐药性，可与抗生素联合使用以降低 CDAD 复发率，具有重要的临床转化价值。未来需进一步明确抗炎因子的化学本质，并开展动物实验及临床试验验证其有效性。

 参考文献：Boonma P, Spinler JK, Venable SF, et al. Lactobacillus rhamnosus L34 and Lactobacillus casei L39 suppress Clostridium difficile-induced IL-8 production by colonic epithelial cells. BMC Microbiology. 2014;14:177. doi:10.1186/1471-2180-14-177.