血清中HBV pgRNA标准化定量检测方法的建立

  乙型肝炎病毒(HBV)感染是世界范围内的一个主要健康问题，世界上约30 %的人口表现出当前或过去HBV感染的血清学证据。尽管目前使用的抗病毒药物可以有效抑制慢性乙型肝炎(CHB)患者的HBV复制和疾病进展，但共价闭合环状DNA(cccDNA)仍难以根除。血清中的HBV RNA主要是非逆转录或部分逆转录前基因组RNA(pgRNA)，并以HBV病毒颗粒样形式存在。而pgRNA只能由cccDNA产生，因此血清HBV pgRNA可作为HBV DNA的替代标志物，反映抗病毒治疗期间HBV DNA丢失时cccDNA的活性。同时，监测血清HBV RNA可预测抗病毒疗效，并可反映停药后HBV病毒反弹的风险。

  血清HBV RNA由全长、剪接变体和3’端截短的pgRNA组成，甚至由超基因组长HBx RNA组成。前期研究发现，针对HBV基因组PreC/C、S或X区检测的血清HBV RNA水平不同，从PreC/C区、S区到X区逐渐降低。此外，2019年欧洲肝病学会(EASL)和美国肝病学会(AASLD)专家建议，血清HBV RNA的检测方法应标准化，且在检测时应明确HBV RNA的类型，如pgRNA、总RNA、剪接RNA或截短RNA。因此，为了优化血清HBV RNA的检测，需要阐明血清HBV RNA种类的动态变化及其对HBV RNA定量检测的影响。

  今年3月，北京大学基础医学院鲁凤民教授团队在《Emerging Microbes & Infections》期刊发表题为“A standardized assay for the quantitative detection of serum HBV RNA in chronic hepatitis B patients”的研究文章。该研究证实了HBV RNA与HBeAg状态和NAs治疗无关，而pgRNA剪接变异体和3’端截短体影响血清HBV RNA的定量检测。

  在这项研究中，首先检测了患者治疗前后血清pgRNA的动态变化，并通过三种RT-qPCR检测体系的设计评价了HBV pgRNA剪接变异体和3’端截短体对血清HBV RNA定量的影响，结果显示PreC/C-RNA在一定程度上可代表血清总HBV RNA的水平，SF-RNA检测体系只能扩增非剪接形式的HBV RNA，XR-RNA检测体系可以检测到X区存在的pgRNA。利用HBV RNA国家标准物质对三组体系的准确性和检测下限进行评估，结果显示PreC/C-RNA、SF-RNA和XR-RNA三种检测体系在对HBV RNA国家标准物质的定量检测中展现出明显不同的精确性和灵敏度(PreC/C-RNA>SF-RNA>XR-RNA)。为进一步探究不同疾病状态下血清pgRNA剪接体和截短体对HBV RNA定量检测的干扰，定量检测未接受抗病毒治疗的慢性HBV感染者血清HBV RNA水平。结果显示，无论是HBeAg阳性还是阴性，PreC/C-RNA的定量水平均显著高于SF-RNA和XR-RNA。最后，对接受NAs治疗后CHB患者的患者基线及血清HBV pgRNA进行定量检测，结果显示PreC/C-RNA水平均显著高于SF-RNA和XR-RNA。此外，部分CHB患者在SF-RNA和XR-RNA区域检测到的血清HBV RNA低于检测下限的时间早于PreC/C-RNA区域，说明在NAs抗病毒治疗下，PreC/C-RNA检测体系不仅拥有最高的灵敏度，并且可以降低假阴性率

  总之，无论HBeAg状态如何、接受NAs治疗与否，pgRNA剪接变异体和3’末端截短体占总pgRNA的比例均足以影响血清HBV RNA的定量检测。该研究的出现将有助于我们更好地理解pgRNA剪接变体和3’末端截断，并进一步指导临床检测血清乙肝病毒RNA。

  原文链接：https://doi.org/10.1080/22221751.2022.2045874