5-羟色胺通过上调FOXO3a促进去血清肝癌细胞增殖

  肝癌是全球男性第五大常见恶性肿瘤和女性第八大常见恶性肿瘤。肝癌新发病例每年增加，且预后差，复发率高。血清素也称为5-羟色胺，是一种神经递质和血管活性物质，除了在中枢神经系统中的重要作用外，许多研究表明，5-羟色胺还发挥着多种神经元外生理和病理功能。在众多的5-羟色胺受体家族中，5-HT2B受体(5-HT2BR)是细胞存活和增殖所必需的，且可启动肝再生，介导肝细胞纤维化，从而参与肝细胞癌的发生。FOXO3a是叉头盒转录因子家族O类成员，在新陈代谢、细胞增殖、应激耐受等方面发挥重要作用，也可能调节哺乳动物细胞的寿命，且有研究表明FOXO3a通过诱导细胞凋亡而发挥肿瘤抑制作用。

  血清剥夺作为一种常见的细胞应激类型，可诱导细胞G0周期阻滞，降低大多数细胞类型的增殖。然而，血清素可以逆转缺乏血清的肝癌细胞的增殖抑制，在缺乏血清素的情况下，肝癌细胞表现出明显的生长抑制，并最终发生完全坏死性死亡。近年来，越来越多的证据表明，FOXO3a可以保证多种细胞在应激条件下的代谢稳定性。FOXO3a丢失可增强细胞对应激的敏感性。然而，FOXO3a在无血清肝癌细胞中的功能研究报道较少。因此，作者研究了FOXO3a在肝癌细胞中的表达模式，阐明了FOXO3a在血清素处理的无血清肝癌细胞中的作用，并探讨了FOXO3a是否作为血清素的下游靶点调节无血清肝癌细胞的增殖。

  结果显示，在血清剥夺条件下，三种肝癌细胞系(Huh7、HepG2和Hep3B)在5-羟色胺作用下的细胞存活率和FOXO3a的表达。无血清培养显著抑制三种肝癌细胞(Huh7、HepG2和Hep3B)的增殖(图1)，并导致FOXO3a的表达减少和核积聚(图2)。FOXO3a基因敲除增强了血清剥夺抑制肝癌细胞增殖的能力(图3)。非磷酸化FOXO3a在肝癌细胞中的过表达逆转了血清剥夺诱导的生长抑制。5-羟色胺逆转无血清培养的Huh7细胞增殖抑制作用，上调FOXO3a表达，但对无血清培养的HepG2或Hep3B细胞的增殖无明显影响。除增殖外，5-羟色胺还可诱导去血清的Huh7细胞AKT和FOXO3a的磷酸化，但对HepG2和Hep3B细胞无此作用(图4)。然而，在无血清培养的Huh7细胞中，5-羟色胺诱导的FOXO3a磷酸化并不能将FOXO3a从胞核输出到胞浆。因此，我们证实了5-羟色胺通过增加FOXO3a的表达来促进HuH7细胞的增殖(图5)。且证明了5-HT2BR的不同表达水平可能有助于5-羟色胺在不同血清剥夺的肝癌细胞中的不同作用。

  总的来说，该研究表明FOXO3a在无血清肝癌细胞中起生长因子的作用，而血清素在5-羟色胺受体5-HT2BR的存在下，通过上调FOXO3a促进无血清肝癌细胞的增殖。 靶向5-羟色胺-5-HT2BR-FOXO3a通路的药物可能为抗癌治疗提供新的靶点。

  图1 5-羟色胺促进无血清Huh7细胞的增殖。(A)Huh7细胞，(B)HepG2细胞，(C)Hep3B细胞(与无血清培养液比较，*P<0.001，NS组无显著差异，双因素方差分析)。(D)在含10%胎牛血清的培养液中加入或不加5-羟色胺(50μM)的Huh7细胞的平均±SD相对活力，P>0.05，双向方差分析。

  图2 血清剥夺降低肝癌细胞中FOXO3a的表达。 Western blot(A)和qRT-PCR(B)分析FOXO3a在含10%胎牛血清(FBS)和无血清(SFM)培养48h的肝癌细胞中的表达; *P<0.05,**P<0.01,t检验。

  图3 FOXO3a对去血清肝癌细胞增殖的影响。(A)Western blot分析FOXO3a-siRNA(siRNA) 与对照细胞(WT)的敲除效率;**P<0.01，t检验。(B)无血清培养的肝癌细胞和转染阴性对照siRNA(NC-siRNA)或FOXO3a-siRNA的肝癌细胞的相对活率;(a)Huh7、Hep3B和HepG2细胞，与SFM+NC-siRNA和SFM+FOXO3a-siRNA比较，**P<0.01，双向方差分析，t检验;(B)含10%胎牛血清(FBS)和FOXO3a-siRNA(b)转染的肝癌细胞的相对活率，均P>0.05，双向方差分析。(C)去血清48h后，pEGFP-c2-FOXO3a-3A和阴性对照肝癌细胞的EdU染色图谱和(D)相对EdU阳性细胞率;**P<0.01，t检验。(E)转染pEGFP-c2-FOXO3a-3A质粒的肝癌细胞的荧光图像(a)和Western blot分析pEGFP-c2-FOXO3a-3A与对照细胞(WT)的转染率(b)。(F)经pEGFP-c2-FOXO3a-3A和阴性对照的肝癌细胞在无血清培养液中的平均相对存活率*P<0.001，双因素方差分析。

  图4 5-羟色胺对去血清肝癌细胞FOXO3a表达和磷酸化的影响。(A、B)Western blot(A)和qRT-PCR分析(B)在加或不加5-羟色胺(5-HT)的无血清培养液(SFM)中培养48h的肝癌细胞FOXO3a的表达;*P<0.05，t检验。(C)在含10%胎牛血清的培养液中加入或不加5-羟色胺(50μM)48h，Western blot分析FOXO3a在HUH7细胞中的表达;(D)在FBS、SFM或5-羟色胺(SFM)无血清培养48h后，FOXO3a在Huh7细胞(a)、HepG2细胞(b)和Hep3B细胞(c)中的亚细胞定位。Huh7细胞(E)、HepG2(G)和Hep3B细胞(I)FOXO3a免疫荧光染色图谱定量;*P<0.05，t检验。(F、H、J) Western blot分析在5-羟色胺(5-HT)存在或不存在的情况下，无血清培养的Huh7细胞(F)、HepG2细胞(H)和Hep3B细胞(J)中总AKT、磷酸化Akt(Ser473;p-AKT)、总FOXO3a和磷酸化FOXO3a(Thr32;p-FOXO3a)。

  图5 5-羟色胺和FOXO3a基因敲除对去血清Huh7细胞的影响。 (A)在5-羟色胺(5-HT)存在下去血清培养的Huh7细胞，转染阴性对照siRNA(NC-siRNA)或FOXO3a-siRNA的相对细胞活率，**P<0.01，双向方差分析。(B)阴性对照siRNA或FOXO3a-siRNA转染血清剥夺的Huh7细胞与5-羟色胺(5-HT)孵育48h后的EdU染色图。(C)流式细胞术分析转染NC-siRNA、FOXO3a-siRNA或5-HT存在下无血清培养的Huh7细胞的细胞周期。