佳节畅饮无忧，灵芝护肝助力！

慢性疾病和饮酒过量是引起酒精相关肝病（ALD）的主要因素。因为酒精摄入会破坏肠道屏障，破坏肠道微生物群的平衡，最终通过病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns ; PAMP）和模式识别受体影响肝脏的免疫反应，导致肝损伤，甚至可能会逐渐发展为酒精性肝炎、纤维化、肝硬化，甚至肝细胞癌。虽然，糖皮质激素等药物治疗已被研究用于预防ALD^[1]，但会导致严重的肝脏负担。因此，除了通过戒酒和营养摄入，人们有必要探索其它方法替代治疗策略来抗ALD。

通过摄入食品中的生物活性化合物来治疗ALD是一种可行的方法。有研究表明，可溶性膳食纤维通过恢复拟杆菌酸促性腺激素水平和促进氨解毒来改善ALD^[2]；水果和蔬菜中发现的多酚，如EGCG和姜黄素，可以通过调节脂肪生成基因表达、减少氧化应激和炎症反应来预防酒精诱导的肝损伤^{[3, 4]}。

灵芝（Ganoderma lucidum）是一种传统的功能性食用菌，具有延年益寿和促进健康的特性。研究发现，灵芝含有多种生物活性成分，包括多糖、三萜、甾醇、生物碱、核苷酸、脂肪酸和其他活性物质。以灵芝成熟子实体和孢子为原料生产的商业产品在市场上最受欢迎。研究表明，灵芝的不同生长阶段，如菌丝体、原基、子实体或孢子，具有不同的活性成分。代谢组学分析表明，与其它阶段相比，在灵芝生长的早期阶段，三萜、甾体和多酚化合物的水平较高^{[5, 6]}。因此，研究灵芝不同生长阶段的生物学功能可能对ALD治疗具有至关重要的作用。

本研究旨在探讨灵芝发酵产物乙醇提取物（G. lucidum fermentation product; GFE）对乙醇诱导的小鼠肝损伤的影响。通过肝脏脂肪组学分析、肠道微生物群和肠道屏障功能评估探索了其潜在机制^[7]。

1 灵芝GFE可以减轻乙醇引起的肝损伤

为了测试GFE是否能保护乙醇喂养的小鼠免受肝损伤，研究人员在使用乙醇饮食喂养期之前和喂养期间，用GFE或生理盐水预处理C57BL/6小鼠7天（图1a）。结果显示，在乙醇喂养期间，GFE缓解了乙醇饮食诱导的小鼠体重减轻症状，与此同时小鼠的肝脏/体重比也降低了（图1b）。

与喂食乙醇饮食的小鼠相比，用GFE预处理的小鼠显示出较低的丙氨酸氨基转移酶（alanine transaminase; ALT）和天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase; AST）血清水平（图1c，d），表明GFE可以减轻乙醇引起的肝损伤。同时，GFE也减少了暴露于乙醇喂养的小鼠肝细胞中脂滴的积聚（图1e）与肝脏甘油三酯（hepatic triglycerides; TG）含量（图1f）。总而言之，GFE可预防乙醇诱导的肝脂肪变性和损伤。

图1 GFE预防了小鼠乙醇诱导的肝损伤和脂肪变性。

2 GFE改善了小鼠乙醇代谢和氧化应激

摄入的酒精主要在肝脏中代谢，乙醇代谢的氧化途径涉及乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase; ADH）、乙醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase; ALDH）、微粒体细胞色素P450酶（microsomal cytochrome P450 enzyme; CYP2E1）或过氧化氢酶。因此，研究人员通过评估代谢酶的表达来评估GFE对肝脏酒精代谢的影响。

在喂食乙醇饮食的小鼠中，将酒精转化为乙醛的主要酶基因Adh上调，而将乙醛转化为乙酸的基因Aldh下调（图2a，b）。相比之下，GFE可以降低Adh的mRNA表达，上调Aldh的mRNA表达水平，同时显著降低了Cyp2e1的mRNA表达（图2c）。

研究人员还测量了肝脏丙二醛（Malondialdehyde; MDA）水平以评估脂质过氧化。如图2d所示，GFE抑制了乙醇诱导的MDA形成，表明GFE改善了氧化损伤以抵消氧化应激。随后，研究人员评估了GFE对血清和肝脏中谷胱甘肽（Glutathione; GSH）水平的影响（图2e，f）。结果显示，用GFE预处理的小鼠血清和肝脏中的GSH水平升高，表明GFE通过刺激抗氧化分子和降低Cyp2e1表达来改善乙醇诱导的肝脏氧化应激。

图2 GFE调节肝脏乙醇代谢，抑制乙醇诱导的氧化应激

3 GFE缓解乙醇诱导的肝脏炎症反应

饮酒会诱导巨噬细胞等免疫细胞释放炎性因子和趋化因子，如Tnf-α、Il1-β和Il-6，引发中性粒细胞浸润和肝脏炎症。因此，研究人员对这些炎性因子和趋化因子表达水平进行评估，发现慢性酗酒饮食模型中的小鼠中，炎症细胞因子和趋化因子（Il1-β、Tnf-α、Cxcl1和Cxcl2）的表达水平高于对照组小鼠（图3a-d）。相比之下，GFE抑制了乙醇诱导的促炎细胞因子的表达，包括Il1-β、Tnf-α和趋化因子Cxcl1、Cxcl2。

髓过氧化物酶（Myeloperoxidase; MPO）是一种在中性粒细胞中表达的酶，在ALD患者的肝脏中上调，通常作为嗜神经细胞浸润的标志。除此以外，研究人员发现暴露于乙醇饮食的小鼠肝脏MPO活性增加，而GFE预处理显著降低了MPO活性（图3e）。以上结果表明，GFE抑制了乙醇饮食诱导的肝脏炎症。

图3 GFE减轻慢性酒精暴露小鼠的肝脏炎症

4 GFE改善肝脏脂肪代谢

磷脂酰胆碱/磷脂酰乙醇胺（PC/PE）比值的降低将导致肝损伤和炎症。抑制肝脏PC合成会损害极低密度脂蛋白的分泌，并促进肝脂肪变性。而极长链脂肪酸（Very-long-chain fatty acids; VLCFAs）可以缓解饮酒引起的生理变化。研究人员对PC/PE及VLCFAs表达水平进行了评估。

脂质热图（图4a）表明，乙醇增加了C22-24饱和/单不饱和脂肪酸和C35-40饱和/单非饱和PE的水平，降低了C38-40不饱和PC的表达水平。结果说明GFE能延缓乙醇诱导小鼠PC/PE比值的降低，并抑制了乙醇诱导的VLCFAs升高。

除此以外，研究人员还检测了参与脂质代谢的肝脏基因的表达（图4b）。与对照组小鼠相比，暴露于乙醇饮食的小鼠肝脏中与从头脂肪生成（De Novo Lipogenesis）相关的基因表达增加，脂肪酸β-氧化（the fatty acid β-oxidation; FAO）途径表达减少。相比之下，GFE预处理下调了脂肪生成基因（Cd36、Pparg和Fads）的表达，上调了与FAO基因相关的基因（Cpt1a、Ppard和Lipe）的表达。

以上结果表明，GFE可以通过调节脂质代谢来缓解乙醇诱导的肝脂肪变性。

图4 GFE改善了乙醇饮食喂养的小鼠的脂质代谢

5 GFE减轻乙醇引起的肠屏障损伤

由于乙醇诱导的肠道渗漏会导致全身性内毒素血症和炎症性肝病，研究人员测量了血清中内毒素LPS的水平，并评估了这些小鼠的肠道屏障功能。如图5a所示，GFE处理的小鼠血清中的内毒素水平低于乙醇喂养的小鼠。

接下来，研究人员研究了GFE对乙醇诱导的紧密连接蛋白（TJP）的影响。结果显示，GFE处理的小鼠显示出比乙醇喂养的小鼠更高的TJ基因（Occludin、Zo1和Claudin-1）的mRNA表达水平（图5b、c和e），表明GFE可以减弱乙醇诱导的TJ基因表达下调。

除此以外，相比起对照组，GFE治疗组的绒毛结构完整，高度更长（图5d），并恢复了肠道化学屏障的抗菌肽3β（Reg3β）和Reg3γ的mRNA水平（图5f，g）。

综上所述，GFE治疗可以改善乙醇诱导的肠屏障功能障碍。

图5 GFE预处理可预防乙醇诱导的肠屏障功能障碍

6 GFE调节乙醇暴露小鼠肠道微生物群

研究人员对两组小鼠的16S rRNA进行测序，以鉴定与GFE治疗特异性相关的细菌分类群。主坐标分析（PCoA）显示，对照组、乙醇组和GFE组的小鼠聚类不同（图6a），但是细菌物种多样性相似（图6b）。与对照组小鼠相比，乙醇暴露小鼠的拟杆菌门菌减少，厚壁菌门菌增加。而GFE处理的小鼠含有更多的拟杆菌门菌（图6c）。

研究发现，酒精依赖与拟杆菌目多个成员的水平呈负相关，已经鉴定出几种拟杆菌属菌株保护小鼠免受ALD，而许多益生菌（如拟副杆菌和拟杆菌）的减少与宿主的代谢表型有关，包括代谢炎症。因此，GFE可能作为一种益生元，促进拟杆菌和其他益生菌的生长和增殖，并防止酒精性肝损伤。

图6 GFE调节肠道微生物群

总之，本研究表明，GFE可以减轻过量摄入乙醇引起的肝损伤和肠道屏障功能障碍。GFE选择性影响ALD小鼠主要肠道微生物群落的发现，突显了肠道微生物群在GFE中保护肝脏和肠道上皮屏障功能的重要性和复杂作用。进一步探索具体GFE改变的细菌种类及其对乙醇诱导的肝脏和肠道上皮屏障功能障碍的影响值得关注。此外，鉴于GFE的化学成分复杂，还需要进一步分离和纯化GFE以确定其保肝功效。

参考文献：

[1] Thursz, M., & Lingford-Hughes, A. (2023). Advances in the understanding and management of alcohol-related liver disease. BMJ (Clinical research ed.), 383, e077090. https://doi.org/10.1136/bmj-2023-077090

[2] Shen H, Zhou L, Zhang H, et al. Dietary fiber alleviates alcoholic liver injury via Bacteroides acidifaciens and subsequent ammonia detoxification. Cell Host Microbe. 2024;32(8):1331-1346.e6. doi:10.1016/j.chom.2024.06.008

[3] Simón J, Casado-Andrés M, Goikoetxea-Usandizaga N, Serrano-Maciá M, Martínez-Chantar ML. Nutraceutical Properties of Polyphenols against Liver Diseases. Nutrients. 2020;12(11):3517. Published 2020 Nov 15. doi:10.3390/nu12113517

[4] Wang F, Liu JC, Zhou RJ, et al. Apigenin protects against alcohol-induced liver injury in mice by regulating hepatic CYP2E1-mediated oxidative stress and PPARα-mediated lipogenic gene expression. Chem Biol Interact. 2017;275:171-177. doi:10.1016/j.cbi.2017.08.006

[5] Gao, X., Huo, H., Bao, H., Wang, J., & Gao, D. (2024). Changes of Active Substances in Ganoderma lucidum during Different Growth Periods and Analysis of Their Molecular Mechanism. Molecules (Basel, Switzerland), 29(11), 2591. https://doi.org/10.3390/molecules29112591

[6] Zhang, X., Lv, W., Fu, Y., Li, Y., Wang, J., Chen, D., Han, X., & Li, Z. (2022). Hepatoprotective Activity of Ethanol Extract of Rice Solid-State Fermentation of Ganoderma tsugae against CCl4-Induced Acute Liver Injury in Mice. Molecules (Basel, Switzerland), 27(16), 5347. https://doi.org/10.3390/molecules27165347

[7] Zhao Z, Ma X, Li M, et al. Alcoholic Extracts from the Ganoderma Lucidum Fermentation Product Alleviated Ethanol-Induced Liver Injury, Gut Leakiness, and Gut Dysbiosis in Mice.Plant Foods Hum Nutr. 2024;80(1):2. Published 2024 Dec 5. doi:10.1007/s11130-024-01271-x