羧甲基壳聚糖如何重塑杏鲍菇蛋白组分，破解菌物基凝胶质构难题？

在全球消费者对健康饮食需求攀升、动物蛋白成本上涨的背景下，植物基蛋白的开发成为食品科学领域的研究热点。然而，传统植物蛋白（如大豆、豌豆蛋白）存在风味不佳、致敏性及必需氨基酸缺乏等问题，且单一蛋白凝胶常因机械强度低、稳定性差难以满足加工需求。杏鲍菇（Pleurotus eryngii）作为工业化程度高的食用菌，其蛋白（PEP）含10%-35%，兼具高营养价值、低致敏性及低成本优势，还具备抗氧化、抗炎等生理活性，且生长周期短、培养条件可控，是理想的新型菌物蛋白来源。

杏鲍菇子实体（图片来源于网络，如有侵权，请联系删除）

前期研究发现羧甲基壳聚糖（CMCS，壳聚糖的水溶性衍生物，兼具凝胶性与生物活性）可改善PEP整体凝胶性能，但PEP中不同关键组分对凝胶形成的贡献及CMCS的调控机制尚不明确。为此，2025年7月南京农业大学食品营养与化学实验室钱正等人在《Carbohydrate Polymers》（IF 12.5，中科院1区）发表研究“Carboxymethyl chitosan-induced modification of the structure and regulation of the thermal aggregation of Pleurotus eryngii protein fractions to improve gel properties”，聚焦PEP的三个关键组分（PEP1-1、PEP2-2、PEP5-1），通过多维度表征与分子对接技术，系统揭示了CMCS通过分子间相互作用调控蛋白结构与热聚集、进而改善凝胶特性的机制，为PEP/CMCS复合凝胶在食品工业的应用提供了理论支撑。

一、实验设计：从组分分离到机制验证的完整链条

为精准解析CMCS与PEP组分的相互作用，研究设计了“分离纯化-体系构建-多尺度表征-机制验证”的技术路线，核心实验环节如下：

1. PEP的制备与关键组分分离

首先采用碱提酸沉法制备PEP：将杏鲍菇粉与去离子水按1:55（w/v）混合，用1M NaOH调pH至12.0，50℃搅拌3小时后离心，上清用1M HCl调pH至3.6沉淀蛋白，透析后冷冻干燥，得到蛋白含量70.99%的PEP。为获取均一性高的关键组分，研究采用“离子交换层析+凝胶过滤层析”两步法：先通过DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析（线性NaCl梯度洗脱，280nm监测），从PEP中筛选出与CMCS相互作用强的3个组分（PEP1、PEP2、PEP5）；再通过Sephadex G-100凝胶过滤层析（去离子水洗脱，基于分子量筛分），进一步纯化得到3个主要单体组分PEP1-1、PEP2-2、PEP5-1，SDS-PAGE验证其分子量分别为39.63 kDa、32.45 kDa、38.34 kDa（图1E）。

图1 DEAE Sepharose Fast Flow和Sephadex G-100洗脱的PEP曲线（A），PEP1（B）、PEP2（C）和PEP5（D）与3.0% CMCS相互作用的荧光及紫外吸收光谱，以及PEP组分的SDS-PAGE分析（E）

2. CMCS-PEP复合体系构建

基于前期研究结论（3.0% CMCS可使PEP凝胶性能最优），构建复合体系：将PEP组分与CMCS分别溶解于去离子水，配制成含1.0%（w/w）蛋白和3.0%（w/w）CMCS的混合分散液（pH调至7.0）。热聚集分散液通过90℃水浴40分钟制备，用于分子形态与结构分析；复合凝胶则由16%蛋白+3.0% CMCS的分散液经相同热处理后冰浴冷却制备，用于性能表征。

3. 多维度表征技术

为全面解析作用机制，研究整合了多种表征手段：

（1）分子形态分析：通过浊度（340nm吸光度）、溶解度（离心后上清蛋白含量）反映聚集状态；粒径与zeta电位（动态光散射）分析胶体稳定性；激光扫描共聚焦显微镜（CLSM，蛋白染红色、CMCS染绿色）观察组分相容性与分布。

（2）功能基团与结构分析：表面疏水性（ANS荧光法）、游离巯基（Ellman法）评估蛋白表面活性位点变化；内源荧光光谱（激发280nm）、紫外光谱（200-400nm）及二阶导数分析 tertiary结构与氨基酸微环境；拉曼光谱（514nm激发，1600-1700 cm⁻¹酰胺I带）定量二级结构（α-螺旋、β-折叠、β-转角、无规卷曲）。

（3）凝胶性能评估：质构分析（TPA，测定硬度、弹性）、持水性（离心法）评价宏观性能；扫描电子显微镜（SEM，3000倍放大）观察微观网络结构。

（4）分子对接验证：以UniProt数据库中PEP同源蛋白（ID：A0A9P6DCH4等）为模板构建三维结构，AutoDock Vina模拟CMCS与蛋白的结合模式，验证相互作用类型与结合能。

二、核心研究结果：CMCS如何多维度调控PEP组分与凝胶性能

研究通过系统表征，揭示了CMCS从分子形态、结构到凝胶性能的全链条调控作用，且对不同PEP组分呈现特异性调控规律。

1. 分子形态调控：抑制无序聚集，形成稳定可溶性聚集体

CMCS对PEP组分分子形态的改变是凝胶性能改善的基础。如图2所示，未添加CMCS时，PEP1-1、PEP2-2、PEP5-1的浊度较高（图2A），溶解度较低（图2B），表明热诱导下易形成不溶性大聚集体；而添加CMCS后，浊度显著降低（p<0.05）、溶解度显著提升，说明CMCS通过空间位阻与静电作用，减少了蛋白分子间的无序聚集，促进可溶性聚集体形成。

粒径与zeta电位的变化进一步验证了这一机制：添加CMCS后，三个组分的粒径均显著增大（图2C，如PEP1-1从944.73 nm增至更大尺寸），但zeta电位绝对值同步升高（图2D，如PEP2-2从-14.87 mV降至-33.03 mV）。这一“粒径增大但稳定性提升”的矛盾可通过CMCS的作用解释：热诱导使蛋白变性展开，CMCS通过非共价相互作用与蛋白交联形成更大聚集体，但CMCS分子上的羧甲基带来强负电荷，增强了聚集体间的静电排斥，有效阻止过度聚集，维持体系稳定。CLSM图像（图3）进一步显示，添加CMCS后，红绿荧光均匀共定位，无宏观相分离，且荧光聚集体面积增大、亮度提升，证明蛋白与CMCS相容性优异，形成了稳定的胶体体系。

图2 CMCS与PEP组分的混合溶液浊度（A）、蛋白质溶解度（B）、粒径（C）及Zeta电位（D）的变化。**表示与不含CMCS的样品相比，含CMCS的样品具有统计学显著差异（p<0.01），n = 3。

图3 CMCS与PEP组分的混合溶液的激光扫描共聚焦显微镜（CLSM）图像（A1和A3：PEP1–1；B1和B3：PEP2–2；C1和C3：PEP5–1）。蛋白质以红色区域显示，CMCS以绿色区域显示。

2. 功能基团与分子结构重构：暴露活性位点，诱导有序结构形成

CMCS通过改变PEP组分的功能基团与分子结构，为有序凝胶网络的构建提供了结构基础。从功能基团看（表1），未添加CMCS时，PEP5-1的表面疏水性最高（858.09），PEP2-2的游离巯基含量最高（91.18 μmol/g）；添加CMCS后，PEP1-1与PEP2-2的表面疏水性显著升高（分别达1282.63、1081.62，p<0.05），三个组分的游离巯基含量均显著增加（PEP2-2达127.94 μmol/g）。这表明CMCS促进了蛋白变性，使原本埋藏的疏水基团与巯基暴露——疏水基团的暴露增强了分子间疏水相互作用，为凝胶聚集提供动力；而巯基含量的增加则暗示二硫键交联减少，更多巯基参与与CMCS的非共价相互作用，避免了过度共价交联导致的凝胶脆性。

表1 在3.0% CMCS存在下PEP组分的表面疏水性与巯基含量

不同小写字母表示显著性差异（p < 0.05），n = 3。

分子结构的变化进一步印证了CMCS的调控作用。内源荧光光谱（图4A）显示，添加CMCS后，三个组分的荧光强度均显著降低，且发射波长轻微红移（如PEP1-1的最大发射波长向长波方向移动），表明CMCS与蛋白发生荧光猝灭，色氨酸残基从疏水微环境转移至极性更高的环境，tertiary结构发生重构。紫外吸收光谱（图4B）中，复合体系的吸收强度显著高于纯蛋白，说明蛋白构象展开，芳香族氨基酸（酪氨酸、色氨酸）的微环境改变；二阶导数紫外光谱（图4C）的峰位分析（表2）进一步显示，PEP1-1的r值（285nm与296nm峰谷比）从1.55降至0.73，表明其色氨酸/酪氨酸微环境极性降低，更倾向于疏水相互作用；而PEP2-2与PEP5-1的r值分别从0.34、0.61升至0.51、1.18，说明极性升高，更易与CMCS形成氢键。

图4 PEP1-1、PEP2-2和PEP5-1在3.0% CMCS条件下的内源荧光（A）、紫外吸收光谱（B）及二阶导数紫外光谱（C）

表2 PEP组分在3.0% CMCS条件下的二阶导数紫外光谱中两峰谷值的振幅比（r = a/b）。

不同小写字母表示差异显著（p < 0.05），n = 3。

拉曼光谱对二级结构的定量分析（图5）揭示了CMCS诱导的结构有序化：未添加CMCS时，PEP组分以α-螺旋和无规卷曲为主；添加CMCS后，PEP1-1与PEP5-1的β-折叠含量显著增加（分别提升约10%-15%），α-螺旋与无规卷曲减少；PEP2-2则呈现独特的β-转角显著增加（提升约20%），α-螺旋与β-折叠减少。β-折叠与β-转角均为高度有序的二级结构，其增加表明CMCS促进蛋白分子重排为更稳定的构象，为致密凝胶网络的形成奠定基础。表3中I850/I830（酪氨酸氢键指标）、I760（色氨酸暴露指标）的降低，进一步证明CMCS增强了蛋白与多糖间的氢键及疏水相互作用，推动结构有序化。

表5 拉曼光谱（500–2000 cm⁻¹，A）及3.0% CMCS条件下PEP1–1（B）、PEP2–2（C）和PEP5–1（D）的蛋白质二级结构百分比。

** 表示含CMCS的样品与不含CMCS的样品相比具有统计学显著差异（p < 0.01），n = 3。

表3 3.0% CMCS混合体系中三种蛋白质组分的归一化强度（760 cm⁻¹、850/830 cm⁻¹及1450 cm⁻¹波段

不同小写字母表示差异显著（p < 0.05），n = 3。

3. 凝胶性能飞跃：从松散多孔到致密均匀，硬度与持水性双提升

结构的有序化最终体现为凝胶宏观性能的显著改善。质构分析（图6A）显示，添加CMCS后，三个组分的凝胶硬度与弹性均显著提升（p<0.01）：如PEP2-2凝胶的硬度从约200 g增至400 g以上，弹性从0.7增至0.9以上。这是因为CMCS的负电荷通过静电排斥阻止蛋白过度聚集，同时CMCS与蛋白间的氢键形成交联点，增强了凝胶网络的抗变形能力。

持水性（WHC）的提升更为显著（图6B）：未添加CMCS时，PEP凝胶的WHC约为40%-60%，添加CMCS后增至80%以上。这一变化与微观结构的改善直接相关——SEM图像（图7）显示，对照组凝胶呈现松散的大孔结构，孔洞直径可达数微米，易导致水分流失；而添加CMCS后，凝胶网络变得均匀致密，孔洞尺寸缩小且分布均匀，水通道显著减少。这是因为CMCS分子上的羟基、氨基与蛋白形成密集的氢键网络，同时其强水溶性可吸附周围水分，将水分固定在凝胶网络中，从而大幅提升WHC。

图6 3.0% CMCS对PEP1-1、PEP2-2和PEP5-1凝胶质构参数（硬度、弹性）（A）和持水性（B）的影响。

**表示含CMCS的样品与不含CMCS的样品相比具有统计学显著差异（p < 0.01），n = 3。

图7 3.0% CMCS对PEP1–1、PEP2–2和PEP5–1凝胶微观结构的影响。

4. 分子对接验证：氢键、疏水作用与盐桥的协同作用

分子对接技术从原子水平揭示了CMCS与PEP组分的相互作用机制（图8）。结果显示，CMCS与三个组分均能形成稳定复合物，结合能分别为-7.1 kcal/mol（PEP1-1）、-6.5 kcal/mol（PEP2-2）、-6.2 kcal/mol（PEP5-1），结合能越低表明结合越稳定。相互作用类型以氢键、疏水作用与盐桥为主：

（1）对PEP1-1，CMCS与Asp110、Arg264形成氢键，与Val237、Pro239形成疏水作用，还与Arg421形成盐桥，多重作用共同增强结合稳定性；

（2）对PEP2-2，氢键起主导作用，CMCS与Asp100、His39、Asn35等多个残基形成氢键网络，精准定位CMCS与蛋白的结合位点；

（3）对PEP5-1，CMCS与Trp307、Lys343形成氢键，与Lys373形成盐桥，疏水作用辅助稳定复合物。

这一结果验证了前期表征的结论：CMCS通过多类型非共价相互作用与PEP组分结合，调控蛋白结构与聚集行为，最终改善凝胶性能。

图8 基于分子对接的PEP组分与CMCS相互作用分析（A: PEP1-1; B: PEP2-2; C: PEP5-1）

三、机制总结与应用展望：从基础研究到食品工业转化

1. CMCS调控PEP凝胶特性的核心机制

综合所有研究结果，CMCS通过“静电排斥-氢键交联-疏水协同”的三重机制，精准调控PEP组分的结构与热聚集，最终实现凝胶性能的提升（图9，示意机制）：

（1）静电排斥奠定基础：CMCS的羧甲基带来强负电荷，与PEP组分结合后提升zeta电位绝对值，通过静电排斥抑制蛋白分子的无序聚集，形成尺寸适中的可溶性聚集体，为有序凝胶网络提供“建筑单元”；

（2）氢键交联驱动结构有序化：CMCS的羟基、氨基与PEP的极性残基（Asp、His、Asn等）形成氢键，诱导蛋白二级结构从无序的α-螺旋、无规卷曲向有序的β-折叠（PEP1-1、PEP5-1）或β-转角（PEP2-2）转变，增强分子间交联强度；

（3）疏水作用促进网络致密化：CMCS促进PEP疏水基团暴露，增强分子间疏水相互作用，推动可溶性聚集体进一步组装为致密均匀的三维网络，减少水通道，提升凝胶硬度与持水性。

这一机制的特异性在于，CMCS对不同PEP组分的调控侧重不同（如PEP2-2以β-转角增加为主），但最终均指向“有序化、致密化”的凝胶网络构建，体现了多糖对蛋白凝胶的精准调控能力。

图9 CMCS调控PEP凝胶特性的核心机制示意图

2. 经济可行性与应用价值

研究还强调了PEP/CMCS复合凝胶的工业应用潜力：从原料成本看，PEP可从杏鲍菇加工副产物（菌柄、小菇）中提取，CMCS来自甲壳类废弃物（虾壳、蟹壳），符合循环经济理念，原料成本低；从工艺看，热凝胶制备（90℃×40分钟）可采用常规食品加工设备，易规模化；从性能收益看，CMCS带来的硬度与WHC提升可减少加工与储存中的水分流失（降低yield loss），减少对昂贵增稠剂、改良剂的依赖，尤其适合植物基肉制品（如素牛排）、乳制品替代品（如植物奶酪）的开发，满足消费者对“质构佳、稳定性高”的植物基食品需求。

3. 未来研究方向

尽管研究取得显著进展，仍有待拓展：

（1）组分间协同作用：当前聚焦单一组分与CMCS的相互作用，需进一步研究PEP1-1、PEP2-2、PEP5-1在CMCS存在下的协同聚集机制，更贴近实际PEP体系；

（2）复杂食品基质适配性：需评估盐、脂、pH等食品加工常见因素对CMCS-PEP凝胶性能的影响，验证其在实际食品配方中的适用性；

（3）营养与消化特性：CMCS可能影响PEP的消化吸收率与氨基酸生物利用度，未来需结合体外消化模型与动物实验，全面评估其营养安全性。

四、总结

本研究以杏鲍菇蛋白的关键组分为切入点，通过多维度表征与分子对接，首次系统揭示了羧甲基壳聚糖（CMCS）通过静电排斥、氢键交联与疏水协同作用，调控蛋白结构与热聚集、改善凝胶特性的机制。研究不仅填补了“多糖-蛋白组分相互作用”领域的空白，为植物蛋白凝胶的精准调控提供了新理论，还为杏鲍菇蛋白在食品工业的高值化应用开辟了新路径——未来，PEP/CMCS复合凝胶有望成为植物基食品领域的新型功能配料，推动“健康、可持续”食品的开发进程。

 原文链接：

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0144861725009014