文献分享｜药用真菌树舌灵芝中的功能性三萜类化合物：对抗脂肪生成剂的持续探索

本期分享的是发布于Bioorganic Chemistry的一篇文章，药用真菌树舌灵芝中的功能性三萜类化合物：对抗脂肪生成剂的持续探索。

【研究背景】

肥胖及其相关的代谢综合征，如II型糖尿病、高血压、高血脂和非酒精性脂肪肝等，已成为全球性的重大公共卫生问题。从生理学角度看，肥胖源于前脂肪细胞的增生（脂肪生成）和脂肪细胞的肥大。因此，抑制前脂肪细胞的增殖与分化，是潜在的抗肥胖治疗策略。

药用真菌因其卓越的治疗功效和保健功能多年来备受关注，其在治疗肥胖、高脂血症及相关代谢疾病方面具有独特优势。灵芝属（Ganoderma）作为全球最受推崇的药用真菌之一，能够改善血脂异常并纠正肥胖相关异常。灵芝真菌是高度氧化的羊毛脂烷型三萜类化合物（GTs）的丰富来源。现有研究揭示了GTs在治疗肥胖及相关代谢疾病方面的潜在应用。例如，从G. lucidum中发现的灵芝酸A能显著降低血清和肝脏中的总胆固醇及甘油三酯水平，减少体重增加，并促进高脂饮食喂养小鼠的能量消耗。在前期的研究中，两个先导化合物gandacapilanoids K和Q在抑制脂肪生成方面表现出优异的效力，不仅能减少脂滴的产生，还能抑制3T3-L1脂肪细胞中的TC和TG水平。树舌灵芝（Ganoderma applanatum）是灵芝属的重要成员。作为对具有抗脂肪生成活性GTs研究的延续，本研究对G. applanatum的乙酸乙酯（EtOAc）提取物进行了系统的植物化学研究，以寻找新的抗脂肪生成剂。

【研究结果】

1.化合物分离与结构鉴定

从树舌灵芝子实体的乙酸乙酯提取物中，共分离得到15个高度氧化的羊毛脂烷型三萜类化合物，其中包括9个新化合物（1–9）和6个已知类似物（10–15）。以化合物1为例进行结构解析。树舌灵芝酸A (1) 为白色无定形粉末。其分子式C₃₀H₄₀O₇（不饱和度为11）是通过高分辨质谱（HRESIMS）中m/z 535.2657 [M + Na]⁺的正离子峰（计算值C₃₀H₄₀O₇Na, 535.2666）推导得出。化合物1的红外光谱显示存在羟基（3443 cm⁻¹）和α,β-不饱和羰基（1680 cm⁻¹）官能团的吸收峰。其紫外光谱在245 nm处也可观察到α,β-不饱和羰基的典型吸收带。化合物1的¹H NMR谱揭示了六个甲基[δ_H 1.09 (3H, s), 1.14 (3H, s), 1.17 (3H, d, J = 7.2 Hz), 1.29 (3H, s), 1.35 (3H, s), 1.39(3H, s), 2.07 (3H, s)]、两个氧次甲基[δ_H 4.39 (1H, d, J = 5.4 Hz), 4.82 (1H, s)]和一个烯烃质子[δ_H 6.22 (1H, s)]的存在（表1）。其¹³C NMR谱显示了30个碳信号，包含两个α,β-不饱和羰基（δ_C 171.5, 141.2, 199.9; 161.0, 126.5, 200.8）、一个非共轭羰基（δ_C 216.8）、一个羧基（δ_C 179.7）以及三个氧化的sp³碳（δ_C 76.1, 81.5, 89.4）。这些波谱数据表明，化合物1拥有一个不寻常的14(13→12)断-羊毛甾烷骨架，其C环去甲基-D环扩环的四环系统与ganoapplanic acid A相似。此外，通过¹H-¹H相关谱（COSY）中H₂-1/H₂-2、H-5/H₂-6和H-15/H₂-16/H-17的相关信号，以及异核多键相关（HMBC）中H-30与C-12和C-14的相关、H-11与C-8、C-9和C-14的相关（图2），证实了其6/6/5/6四环系统的核心骨架。

基于HMBC中H₃-19与C-9 (δ_C 171.5)的相关、H₃-30与C-8 (δ_C 141.2)的相关、H₃-21与C-20 (δ_C 161.0)和C-22 (δ_C 126.5)的相关，确定了两个α,β-不饱和酮片段分别位于C-9/C-8/C-7和C-20/C-22/C-23。3-酮基的位置通过H₃-28和H₃-29与该碳(δ_C 216.8)的HMBC相关得以揭示。同时，OH-11的归属是基于H-12与氧化的sp³碳(δ_C 76.1)的HMBC相关。C-15和C-13之间存在氧桥的证据来自于H-15与氧化的sp³碳(δ_C 89.4)的HMBC相关，并结合不饱和度计算得到证实。

OH-11和氧桥的相对构型通过NOESY谱确定其为β-取向，依据是H-11与H-12和H₃-18的相关、H-12与H₃-30和H-17的相关、H-15与H₃-30的相关，以及H₃-19与H-11之间未观察到相关峰。H-22与H₂-16和H-17的NOESY相关表明Δ²⁰(²²)双键为E构型（图3）。此外，基于其相同的骨架和相似的化学位移，C-25手性中心的构型被确定与ganoapplanic acid A相同。通过比较其实验和计算的ECD数据（图4），进一步确定了化合物1的绝对构型。因此，化合物1的结构被定义为(25S)-11β-羟基-13β,15β-环氧-3,7,23-三氧代-14(13→12)断-羊毛甾-8,20(22)E-二烯-26-酸（图1），并命名为树舌灵芝酸A。

2.抗脂肪生成活性筛选与作用机制

利用3T3-L1前脂肪细胞分化模型，评估了乙酸乙酯提取物（GAE）和分离得到的化合物（1–4, 6–15）的抗脂肪生成活性。油红O染色结果显示，GAE（25 μg/mL）以及化合物2, 6, 9, 10（20 μM）能显著抑制3T3-L1脂肪细胞中的脂质积累。细胞活力实验表明，活性最显著的化合物9在高达200 μM的浓度下对3T3-L1细胞没有表现出细胞毒性。Western blot蛋白印迹分析揭示，化合物9通过下调脂肪细胞分化和脂肪生成过程中的关键蛋白（PPARγ, CEBPβ和FAS）的表达来有效抑制脂肪生成。

【研究结论】

本研究从树舌灵芝中分离鉴定了15个三萜类化合物，其中9个为新化合物，并发现了具有新颖C-13/C-15氧桥的重排三萜结构。活性研究表明，树舌灵芝的乙酸乙酯提取物及其中分离得到的多个三萜单体（特别是化合物9）在3T3-L1脂肪细胞模型中展现出优异的抗脂肪生成效果。作用机制研究表明，化合物9通过下调关键转录因子PPARγ、C/EBPβ和脂肪合成关键酶FAS的表达来抑制脂肪生成。本研究进一步证实了灵芝三萜（GTs）在抑制脂肪生成方面的潜力，为肥胖治疗提供了一个可能的天然产物研发视角。

期刊网址：

https://www.sciencedirect.com/journal/bioorganic-chemistry