《食品科学》：华南农业大学李斌教授等：富硒蛹虫草多糖的结构表征及体外免疫调节活性

蛹虫草（Cordyceps militaris）又称北冬虫夏草、北虫草。多糖是蛹虫草的重要活性成分之一，具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化以及降血糖等功能活性。硒（Se）是人体必需的微量元素之一，具有抗氧化、抗癌、免疫调节、预防克山病等生理功能。但硒不能在人体内合成，必须从食物中获取。研究证明，利用灰树花、平菇等食用菌，通过生物转化的方式富集硒，可获得有生物价值的富硒多糖。富硒蛹虫草已实现人工培育，且开展了富硒蛹虫草多糖的提取分离、结构特性、生物活性等研究，但对其免疫调节活性的研究仍鲜有报道，活性作用的机制更有待阐明。

华南农业大学食品学院姚艳婷 、李斌*、高雄*等人从富硒蛹虫草子实体中分离纯化出一种多糖组分SeCMP0.2，对其结构特性表征，并利用小鼠单核巨噬细胞RAW264.7模型探究其体外免疫调节活性，以期为富硒蛹虫草多糖资源的综合利用和新型健康的硒源产品开发，提供前期的研究基础。

1 SeCMP0.2结构特性分析

1.1 SeCMP0.2分子质量及纯度分析

通过水提醇沉、除蛋白，结合阴离子交换层析柱法分离纯化，从富硒蛹虫草子实体中获得多糖组分SeCMP0.2，经HPGPC仪测得的分子质量分布如图1所示。SeCMP0.2的mw为440.7 kDa，分子质量分散指数为1.4，表明SeCMP0.2为均一多糖。由电感耦合等离子体质谱仪分析测定可知，SeCMP0.2的硒含量为49.1 μg/g。由图2可知，SeCMP0.2在260 nm和280 nm波长处均无明显特征吸收峰，说明其几乎不含核酸和蛋白质类物质，纯度较高。

1.2 SeCMP0.2的单糖组成分析

采用离子色谱分析SeCMP0.2的单糖组成，结果如图3所示。SeCMP0.2主要由半乳糖、葡萄糖、甘露糖组成，这3种单糖的含量依次为53.1%、8.2%、37.1%。另外，SeCMP0.2的半乳糖醛酸和古罗糖醛酸含量分别为1.1%和0.5%，表明该糖为杂多糖。

1.3 SeCMP0.2的红外光谱分析

如图4所示，SeCMP0.2在3370.61 cm-1处的特征吸收峰为O—H伸缩振动，2923.67 cm-1和2853.18 cm-1处的吸收峰分别由—CH2的对称伸缩振动和C—H的伸缩振动所致，这是糖类物质的2个特征吸收峰。进一步分析发现，1656.36 cm-1处是C=O伸缩振动吸收峰，1541.35 cm-1处可能为N—H弯曲振动吸收峰，1457.46 cm-1处为C—H变角振动吸收峰，1412.46 cm-1处为C—H弯曲振动吸收峰，1221.23 cm-1处由C—O不对称伸缩振动引起，1000～1200 cm-1范围内为C—O—C和C—O—H伸缩振动的特征吸收峰，表明SeCMP0.2存在吡喃糖环结构，在892.51 cm-1处的吸收峰说明存在β-糖苷键和呋喃糖环结构，在814.60 cm-1和577.91 cm-1处的吸收峰说明存在α-糖苷键，表明SeCMP0.2同时含有α和β构型糖基。

1.4 SeCMP0.2的甲基化分析

为进一步获得SeCMP0.2的结构信息，采用GC-MS分析SeCMP0.2的糖苷键类型，结果如表2所示。SeCMP0.2中末端残基、分支残基和线性残基的种类分别有3、6种和6种。SeCMP0.2的优势残基T-Galp-(1→、→2)-Galp-(1→、→6)-Manp-(1→分别占16.6%、29.4%、26.9%。其他残基占比较小，均低于10%。说明SeCMP0.2主要以半乳糖和甘露糖糖苷键连接，少量以葡萄糖糖苷键连接，与单糖组成的分析结果一致。

1.5 SeCMP0.2的NMR波谱分析

SeCMP0.2的1H-NMR和13C-NMR波谱分析结果如图5所示。化学位移主要集中在δ（H）3.0～5.3和δ（C）50.0～110.0，属于多糖信号峰。在δ（H）4.3～5.3和δ（C）98.0～108.0出现的异头信号表明，SeCMP0.2存在α和β构型糖基。一般异头氢信号高于5.0，在α构型中有化学置换，而异头氢信号低于5.0，在β构型中有化学置换。从图5A可以看出，SeCMP0.2在δ（H）5.0～5.3处的异头氢信号较强，而在δ（H）4.3～5.0处的异头氢信号相对较弱，说明SeCMP0.2以α构型糖基为主。从图5B可见，SeCMP0.2的糖苷键异头碳信号出现在δ（C）98.3～108.1，δ（C）170.0～175.0范围内有2个微弱的糖醛酸特征信号吸收峰，说明SeCMP0.2是酸性多糖。这些结果与上述红外光谱、单糖组成的分析结果一致。

1.6 SeCMP0.2的三螺旋结构分析

刚果红是一种酸性试剂，在一定NaOH浓度范围内，可与具有三螺旋结构的多糖形成络合物，其最大吸收波长λmax与刚果红对照组相比发生红移，以此鉴定多糖中是否存在三螺旋结构。如图6所示，与刚果红对照组相比，SeCMP0.2-刚果红溶液在NaOH浓度0.05～0.4 mol/L范围内发生红移，在NaOH浓度为0.3 mol/L时，其λmax发生位移最大，达到7.5 nm。已有研究表明，食用菌来源的香菇多糖、灵芝多糖及猴头菇多糖也具有三螺旋结构，在刚果红溶液中发生类似的红移现象。由此说明，SeCMP0.2存在三螺旋结构。

1.7 SeCMP0.2的分子形貌观察

采用AFM观测SeCMP0.2在水溶液中的糖链形貌和尺寸。从图7A平面图可见，SeCMP0.2在水溶液中呈现大量不规则球形颗粒。图7B显示出许多山状突起，部分糖链高度在1.0～2.5 nm之间，而单个糖链高度介于0.1～1.0 nm之间，表明SeCMP0.2在水溶液中会发生聚集，并不是都以单个糖链分子存在。类似现象在蛹虫草多糖、白肉灵芝多糖中也有发现，可能是由于多糖通过分子间氢键及范德华力发生相互缠绕，形成不规则的聚集体所致。

2 SeCMP0.2的免疫调节活性

2.1 SeCMP0.2对RAW264.7细胞增殖和NO产生的影响

由图8A可知，与对照组相比，SeCMP0.2质量浓度为100 μg/mL和200 μg/mL时，细胞存活率分别为104.5%和102.8%，对细胞有一定的促进增殖作用；当质量浓度为400 μg/mL和800 μg/mL时，细胞存活率分别为95.4%和94.8%，但与对照组均无显著差异。NO作为一种重要的信号传导介质，参与免疫应答相关的生理过程，因此本研究进而采用Griess试剂法测定细胞培养上清液中的NO2-含量，以反映NO产生量，结果如图8B所示。与对照组（2.7 μmol/L）相比，SeCMP0.2质量浓度在200、400、800 μg/mL时，可显著促进RAW264.7细胞产生NO，产生量依次为6.9、12.4、15.9 μmol/L，而在100 μg/mL时无显著促进作用。因此，为更好地研究SeCMP0.2的免疫活性机理，选择400～800 μg/mL开展后续实验。

2.2 SeCMP0.2对RAW264.7细胞炎症因子mRNA表达水平的影响

为探究SeCMP0.2对RAW264.7细胞炎症因子转录的调控作用，本研究采用real-timePCR检测iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA的表达水平，结果如图9所示。与对照组相比，用400 μg/mL和800 μg/mL的SeCMP0.2处理后，显著提高RAW264.7细胞iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA的表达水平。在质量浓度为800 μg/mL时，上述4种细胞炎症因子mRNA的表达量依次为对照组的2.1、2.0、12.8、83.2倍。巨噬细胞通过产生各种炎症因子，如NO、TNF-α、IL-6、IL-1β等发挥其免疫功能。NO的产生受诱导型iNOS调控，是巨噬细胞被激活的重要标志。TNF-α、IL-6、IL-1β等细胞因子的产生可有效激活其他免疫细胞，刺激先天免疫应答从而发挥免疫调节作用。结果表明，SeCMP0.2可在转录水平上促进RAW264.7细胞中相关炎症因子mRNA表达。

2.3 SeCMP0.2对RAW264.7细胞MAPKs和NF-κB信号通路的影响

为探究SeCMP0.2的免疫调节活性是否受MAPKs、NF-κB信号通路调控，本研究采用Westernblot技术检测信号通路相关蛋白的表达水平。由图10可知，与对照组相比，以400、800 μg/mL的SeCMP0.2处理RAW264.7细胞后，能显著提高JNK、ERK、p38蛋白的磷酸化水平，当质量浓度为800 μg/mL时，p-JNK、p-ERK、p-p38蛋白表达量分别为对照组的2.3、1.6、1.2倍。由图11可知，与对照组相比，400、800 μg/mL的SeCMP0.2处理能够显著提高NF-κB p65蛋白的磷酸化水平，降低IκBα蛋白的表达量，当质量浓度为800 μg/mL时，p-NF-κB p65和IκBα蛋白表达量分别为对照组的1.6倍和0.3倍。NF-κB是巨噬细胞发挥免疫活性的一种关键转录因子，在未激活状态下，其以二聚体的形式存在于细胞质中，与IκB蛋白形成复合物而受到抑制。当巨噬细胞被激活时，NF-κB或IκB蛋白磷酸化而导致复合物解体，IκB蛋白进一步被泛素化而降解，NF-κB从细胞质转移到细胞核中，与相应的炎症相关基因结合，进而启动炎症因子转录。MAPKs是一种具有丝氨酸/苏氨酸特异性的蛋白激酶家族，主要包含JNK、ERK和p38三条信号途径。通过上述结果分析可知，SeCMP0.2可通过激活MAPKs和NF-κB信号途径，促进炎症因子的转录，从而发挥免疫调节作用。

结论

本研究从富硒蛹虫草子实体中成功分离出纯度高、均一性好的多糖组分SeCMP0.2，其重均分子质量为440.7kDa，分子质量分散指数为1.4，硒含量为49.1 μg/g，具有典型的多糖官能团和三螺旋结构，在水溶液中会发生聚集。SeCMP0.2是一种以半乳糖（53.1%）、葡萄糖（8.2%）、甘露糖（37.1%）为主的杂多糖，其优势残基为T-Galp-(1→、→2)-Galp-(1→、→6)-Manp-(1→，且同时含有α和β构型糖基，且以α构型糖基为主。免疫活性研究表明，SeCMP0.2可激活RAW264.7细胞中的MAPKs、NF-κB信号途径，促进iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA等炎症因子表达，从而发挥免疫调节作用。本研究为富硒蛹虫草资源开发成功能性食品，作为缺硒和免疫力低下人群的免疫调节剂，拓展健康硒源产品提供一定的科学依据。

本文《富硒蛹虫草多糖的结构表征及体外免疫调节活性》来源于《食品科学》2023年44卷第22期39-48页，作者：姚艳婷, 杨小兵, 陈旭洁, 陈忠正, 林晓蓉, 张媛媛, 向杰, 陈少丹, 焦春伟, 李斌, 高雄。10.7506/spkx1002-6630-20230217-161。