石耳科大部分生长在高海拔区域的岩石上，最常见的是石耳。据《中药大辞典》记载，石耳性甘、无毒，本草纲目中记载，石耳具有消炎去毒的功效。黑石耳是石耳科的外类群，与石耳科祖先相近，进化程度上甚至低于内类群，故其地衣体在中医里被称之为黑石耳，可以治疗消化不良，痢疾和高血压。石耳与黑石耳的表形相似，形态上难以明确区分，故而民间经常难以区分造成混用。

炎症因子的过量表达与很多中枢系统疾病相关，如脑出血患者发病后，细胞会释放趋化因子和炎性因子等有毒物质，从而加剧神经元损伤。阿尔兹海默病患者体内肿瘤坏死因子α（ＴＮＦ⁃α）和炎性因子也比健康人含量增多。

分析

1  分离纯化与均一性鉴定

采用常规热水提取法，从黄山（Ｈ），宁安（Ｎ），张家界（Ｚ）和神农架（Ｓ）４个不同产地原材料中分别获得粗多糖黄山石耳多糖（HUE），宁山石耳多糖（NUE），张家界黑石耳多糖（ZDM）和神农架黑石耳多糖（SDM），提取率的质量分数分别为5.1％，8.41％，5.6％和7.88％。粗多糖经反复冻融，脱蛋白，DEAE SepharoseCL⁃6Ｂ色谱和透析（截留相对分子质量3500）等分离纯化后，冷冻干燥得到纯化样品HUEP，NUEP，ZDMP和SDMP，得率的质量分数分别为20％，15.4％，48％和38.25％。

使用ks⁃804色谱柱的分子筛功能，对HUEP，NUEP，ZDMP和SDMP进行均一性分析，其HPSEC结果见图１。结果显示，HUEP和NUEP峰型单一，说明其均一性较好，由分子质量相对均一的糖链聚合而成。而ZDMP和SDMP并非单一峰，说明它们是由多种不同分子质量的糖链聚合而成。

2  理化性质与微观结构分析

采用FTIP检测特征官能团，以确定各纯化样品的物质成分，结果见图２。HUEP，NUEP，ZDMP和SDMP在3400cm-1（OH伸缩振动吸收峰），2920cm-1（弱的CH伸缩震动峰），1640cm-1（CO吸收峰）和1040cm-1（COC震动峰）４处均有吸收峰，它们代表糖类物质的特征官能团，说明HUEP，NUEP，ZDMP和SDMP均为糖类物质 。

经190～800nm全波谱扫描，HUEP，NUEP，ZDMP和SDMP均不含有蛋白质和核酸类物质。根据葡萄糖标准曲线Y=0.02X+0.01（Ｒ2＝0.99），各糖样的糖含量计算结果见表１，显示糖含量均超过94％。综合以上结果，4种纯化样品都是多糖聚合物，不含其他成分。

根据各标准葡聚糖建立分子质量标准曲线并计算HUEP，NUEP，ZDMP和SDMP的相对分子质量，结果见表１。多糖HUEP，NUEP，ZDMP和SDMP经硫酸完全水解后，将水解物注射入SUGARSP0810色谱柱，通过HPLC进行单糖组成分析，结果见图３。对照标准品可知，出峰时间在17，19，20和23min的物质分别是葡萄糖，木糖，半乳糖和甘露糖，根据各峰面积可以计算单糖摩尔比。由于葡萄糖和木糖峰型重叠，定量分析不准确，进而对水解产物衍生化后进行GC分析。结果显示（图４），HUEP，NUEP，ZDMP和SDMP由葡萄糖，木糖，半乳糖和甘露糖组成，与HPLC单糖组成分析结果一致，且葡萄糖和木糖的出峰时间没有重叠，可以准确进行定量分析。结合各多糖水解产物的HPLC和其衍生物GC分析，各单糖组成结果汇总见表１。4种纯化多糖均由葡萄糖，木糖，半乳糖和甘露糖组成，HUEP和NUEP相对分子质量和单糖摩尔比例极其相似，说明同一物种中纯化的主要多糖性质相同，产地不同并没有影响其主要多糖成分有所区别，但石耳与其外类种黑石耳中的主要多糖特性却完全不同，石耳多糖各种单糖占比相对均匀，且分子均一性好。

根据TEM观察微观结构，结果见图５。HUEP呈长线状，糖链交织在一起，缠绕聚合不高，NUEP相对呈短线状，3道多股链缠绕，二者均是无分支结构。ZDMP和SDMP由长短不一的链组成，缠绕聚合在一起，这与均一性检测结果一致。

3  抗炎作用研究

为确保后续实验是在纯化糖样对ＲＡＷ264.7细胞无细胞毒状态下进行，首先确定HUEP，NUEP，ZDMP和SDMP的细胞毒性。实验结果显示，添加75μg·mＬ-1的ZDMP或SDMP，5μg·mＬ-1的NUEP或HUEP对RAW264.7细胞生长没有细胞毒性，因此选择各上述浓度进行后续抗炎活性研究。

以GAPDH为内参基因，采用qpCR检测炎症因子TNF⁃α、ＩL⁃６、ＩL⁃１β和COX⁃2ｍRNA相对表达量，各基因熔解峰曲线见图６，结果显示各峰单一对称且尖锐，说明各相关基因的引物特异性非常好，可以进行下一步定量计算。各炎症因子相对表达量的结果见图７，添加1μg·mＬ-1LPS建立炎症模型作为阴性对照组（图７中标记为LPS组），与空白组相比较，阴性对照组TNF⁃α、ＩL⁃６、ＩL⁃１β和COX⁃2ｍRNA相对表达量均显著增加（P＜0.0001），说明炎症模型构建成功。

与阴性对照组相比，添加质量浓度75μg·mＬ-1地塞米松（DXMS）的阳性对照组（图７中标记为DXMS组）显著下调了TNF⁃α、ＩL⁃６、ＩL⁃１β和COX⁃2ｍRNA相对表达量（Ｐ＜0.05），抑制率分别为51.46％、76.8％、61.6％、83.9％。HUEP和NUEP能显著降低LPS刺激RAW264.7细胞的ＩL⁃１β（Ｐ＜0.0001）ｍRNA相对表达量，抑制率分别为89.06％和84.73％， 均显著高于阳性对照组（Ｐ＜0.001）。但HUEP和NUEP对其他炎症因子（ＩL⁃６和COX⁃２）没有抑制效果。ZDMP和SDMP则能显著降低全部炎症因子ＴＮＦ⁃α（ZDMP＝65.31％，SDMP＝54.95％，Ｐ＜0.0001）、ＩL⁃１β（ZDMP＝77.49％，SDMP＝80.64％，Ｐ＜0.0001）、ＩＬ⁃６（ZDMP＝56.61％，SDMP＝56.97％，Ｐ＜0.05）和COX⁃２（ZDMP＝58.11％，SDMP＝49.58％，Ｐ＜0.05）ｍRNA的相对表达量，且对ＩＬ⁃１β的抑制效果高于阳性对照组（Ｐ＜0.05），对ＴＮＦ⁃α和ＩＬ⁃６的抑制效果与阳性对照组相当（Ｐ＞0.05）。

综上所述，多糖ZDMP和SDMP综合抗炎效果更好，但HUEP和NUEP对炎症因子ＩL⁃１β有更好地抑制效果。

结论

从４种不同产地的石耳和黑石耳中分离纯化得到多糖HUEP，NUEP，ZDMP和SDMP，得率分别为质量分数20％，15.4％，48％ 和38.25％。FTIR确定它们均含有糖类物质的特征官能团，4种纯化多糖的糖含量均超过94％，均不含蛋白质和核酸类大分子。HUEP和NUEP特性相似，由均一性多糖组成，各单糖组分（葡萄糖、木糖、半乳糖和甘露糖）比例相对均一。ZDMP和SDMP则由不均一的多糖链聚合而成，单糖组成为葡萄糖、木糖、半乳糖和甘露糖，其中葡萄糖占比相对高。TEM显示HUEP和NUEP都是无分支结构，HUEP由长链交织而成，NUEP则由相对较短的链缠绕成聚合物。ZDMP和SDMP由长短不一的糖链聚合而成。在LPS刺激下的RAW264.7细胞中，成功建立了ＴＮＦ⁃α、ＩＬ⁃６、ＩＬ⁃１β和COX⁃２过表达的炎症因子模型，５μg·mＬ-1的HUEP和NUEP能显著降低ＩＬ⁃１β的ｍRNA相对表达量，抑制率分别为89.06％和84.73％。ZDMP和SDMP则能显著降低４种炎症因子的ｍRNA相对表达量，且对ＩＬ⁃１β的抑制效果高于阳性对照组（Ｐ＜0.05），对ＴＮＦ⁃α和ＩＬ⁃６的抑制效果与阳性对照组相当。

石耳和黑石耳形态相似难以区分，黑石耳作为外类群进化程度上甚至低于石耳内类族群。本研究从石耳和黑石耳的药用成分出发，确定二者主要多糖的特性和空间结构的明显区别，探究出它们在抗炎方面有不同的生物活性效果。

参考资料：

[1]王昭晶,曹森.石耳与黑石耳多糖的抗炎作用研究[A].中国药学杂志,2022:24-29.