[精读]Engineering ||本草基因组团队解析药用模式真菌灵芝的时空组学及灵芝酸生物合成机制

灵芝作为药食两用的“仙草”，在中医药中已有2000多年应用历史。由于其基因组小、生长周期短、遗传体系完善等特点，灵芝已成为研究真菌发育与天然产物代谢合成的药用模式真菌。

2025年4月10日，东北林业大学、中国中医科学院中药研究所、浙江寿仙谷医药股份有限公司等多家单位联合在中国工程院院刊《Engineering》（IF2024=10.1）在线发表了题为“Unveiling the Spatiotemporal Landscape of Ganoderma lingzhi: Insights into Ganoderic Acid Distribution and Biosynthesis”的研究论文，通过时空多组学技术系统解析了灵芝酸的生物合成机制。通过空间质谱成像技术精准绘制了灵芝酸在原基和子实体中的时空动态分布图谱；完成灵芝T2T完整基因组测序并构建了高分辨率单细胞转录组图谱，成功解析了子实体皮壳层的发育轨迹；发现一个新颖的CYP450酶特异性催化生成灵芝酸关键中间体——丹芝酸E和F。该研究为阐明灵芝酸复杂的生物合成网络提供了时空多组学研究范式，为开发灵芝酸小分子创新药物和实现资源可持续利用奠定理论基础。

东北林业大学生命科学学院都昱朋、彭爽、澳门大学中华医药研究院陈虹果、中国中医科学院中药研究所李俊为论文的共同第一作者。东北林业大学生命科学学院徐志超、刘成伟、浙江寿仙谷植物药研究院李振皓、中国中医科学院中药研究所孙伟为该论文的共同通讯作者。埃及开罗大学Mohamed A. Farag教授、日本静冈大学Hirokazu Kawagishi教授、Jing Wu副教授等参与指导该工作。该研究工作得到了国家重点研发计划（No. 2023YFC3504104、No. 2024YFD2100701）、国家自然科学基金（No. 32370069）、浙江省自然科学基金杭州区域创新发展联合基金（No. LHZSZ24H280003）、农业新品种选育重大科技专项（No. 2021C02073）以及中央引导地方科技发展资金项目（No. 2024ZY01009）的资助。

【注】本文在编辑或排版过程中可能存在错误和不足，如发现错误或存在不妥，请查看原文，或联系编辑更改，感谢您的支持和关注图片图片

摘要

灵芝（Ganoderma lingzhi）在传统中医中被誉为 “仙草”，已成为一种重要的药用模式生物。灵芝中的灵芝酸（GAs）是具有显著治疗作用的强效三萜类化合物。然而，目前对GA生物合成途径的了解仍十分有限，这限制了其大规模商业化应用。因此，本研究利用高分辨率基质辅助激光解吸电离质谱成像技术（MALDI-MSI）对灵芝原基和子实体中GA的空间分布进行了mapping，发现 GA主要积累于灵芝的菌壳中。此外，研究还组装了两个单倍体灵芝菌株的端粒到端粒（T2T）基因组，其完整性和质量达到了目前报道的最高水平。基于T2T基因组，构建了灵芝子实体的高分辨率单细胞转录组图谱，鉴定出六种不同的细胞类型，并重构了菌壳的发育轨迹。通过多组学分析，注释了一种新的细胞色素P450酶（GlCYP512A3），该酶可催化GA前体GA-HLDOA氧化生成丹芝酸E和F。总之，本研究为灵芝提供了一个全面的时空多组学框架，为破译复杂的 GA 生物合成和调控网络提供了关键见解。

论文设计思维导图

研究背景

灵芝（Ganoderma lingzhi；G. sichuanense；同义词：G. lucidum sensu auct. Sina），全球闻名的 “仙草”，已在中国传统医学中应用超过 2000 年。由于其基因组小、生长周期快且遗传转化系统成熟，灵芝已成为研究药用蘑菇发育调控和天然产物生物合成的理想模式生物 ^[1]。模式物种的时空多组学数据加深了对真菌药材形成分子机制的理解，为天然产物代谢工程、高产优质品种分子设计育种及物种鉴定提供了有价值的见解（图1）^[2]。

图1. 将灵芝用作药用模式蘑菇的综合框架，整合多组学技术、分子机制与实际应用。MVA：甲羟戊酸；CYP450：细胞色素 P450；LSS：羊毛甾醇合酶。

灵芝子实体和孢子含有多种生物活性物质，包括多糖、萜类化合物、糖肽、核苷酸和甾体化合物 ^[3]。其中，灵芝酸（GAs）是仅存在于灵芝属物种中的特有三萜类化合物 ^[4]，具有抗癌 ^[5]、抗炎 ^[6]、抗氧化 ^[7]、抗衰老 ^[8]、保肝 ^[9] 和护肾 ^[10] 等特性。灵芝酸通常从灵芝子实体和孢子中提取，但其浓度低且可获得性有限，导致其工业和药用应用受到限制。因此，代谢工程和分子育种已成为实现灵芝酸高产的有力工具 ^[11]。

迄今为止，已有超过 200 种灵芝酸（GA）化合物被分离和鉴定 ^[12]。然而，灵芝酸的生物合成途径尚未完全阐明。具体而言，仍需鉴定负责羊毛甾醇（GA 生物合成中的关键中间体）氧化修饰的细胞色素 P450（CYP450）酶。GA 的生物合成通过甲羟戊酸（MVA）途径进行，其中羊毛甾醇在羊毛甾醇合酶（LSS）的催化作用下合成，随后通过各种 CYP450 酶的作用将羊毛甾醇转化为结构和功能各异的 GA ^[1]。例如，GlCYP5150L8催化羊毛甾醇的三步氧化反应生成3 - 羟基羊毛甾 - 8,24 - 二烯 - 26 - 酸（GA-HLDOA），GlCYP5139G1 进一步将 GA-HLDOA 转化为 3,28 - 二羟基羊毛甾 - 8,24 - 二烯 - 26 - 酸（GA-DHLDOA），而 GlCYP512W2 则催化 GA-HLDOA 生成 GA-Y 和 GA-Jb ^[13-16]。尽管上游生物合成酶和部分 CYP450 酶已被报道，但由于 GA 的结构多样性，下游氧化修饰步骤仍 largely unknown。不同灵芝生长阶段的 GA 结构类型和含量不断变化，这可能与生物合成机制及周围环境密切相关 ^[17]。基质辅助激光解吸电离质谱成像技术（MALDI-MSI）可直接可视化 GA 的时空分布，端粒到端粒（T2T）基因组为分析 GA 生物合成途径提供了完整准确的遗传蓝图，而单细胞转录组学则能在细胞水平鉴定基因表达模式 [18]。这些技术共同为解析介导 GA 生物合成的时空特异性分子机制提供了有价值的见解。

因此，本研究利用基质辅助激光解吸电离质谱成像技术（MALDI-MSI）观察了灵芝子实体中灵芝酸（GAs）的空间分布，并对灵芝单倍体菌株的端粒到端粒（T2T）基因组进行了组装和注释。此外，首次构建了灵芝单细胞转录组图谱，并确定了子实体菌壳的细胞发育轨迹。通过整合这些多组学方法，研究阐明了 GA 生物合成时空特异性的分子机制，并成功注释了一个与 GA 生物合成相关的新细胞色素 P450 酶。该时空多组学框架为剖析灵芝中 GA 合成的复杂生物合成网络提供了基础。

结果分析

为了探索灵芝酸的空间分布，研究团队使用MALDI质谱成像技术对不同成熟阶段的原基、子实体中的24种灵芝酸类化合物进行空间定位，发现灵芝酸类化合物特异性分布在灵芝的皮壳层。

图 2. 利用 MALDI-MSI 分析灵芝不同时期灵芝酸（GAs）的空间分布。(a) 灵芝样品垂直纵切面示意图。(b) 不同成熟阶段灵芝不同组织中检测到的灵芝酸空间分布信号。

团队完成了端粒到端粒（T2T）水平的灵芝单倍体基因组精细图谱；基于灵芝T2T基因组，首次绘制了灵芝子实体单细胞转录组，通过基因标记物注释到灵芝皮壳层外层、皮壳层中层、皮壳层内层、菌肉层、菌管层和孢子等6种细胞类型，发现已报道的灵芝酸生物合成基因在灵芝皮壳层外层中显著高表达。

图 3. 灵芝端粒到端粒（T2T）无间隙参考基因组。

(a) 单倍型 A、单倍型 B 与 G260125.1 基因组的共线性分析。灰色线条表示共线区域，G260125.1 基因组中所有闭合的间隙区域以黄色块显示，三角形表示端粒序列重复的存在。GLA/GLB 分别代表灵芝 A（GLA）和灵芝 B（GLB）组装的染色体。(b) 灵芝基因组组装的环形图（Circus plot）。独立 y 轴标签如下：a：单倍型 A 和 B 各自组装的 13 条染色体；b：CG 含量；c：重复序列密度；d：基因表达；e：基因密度；f：单倍型 A 与 B 之间的共线性关系。(c) 16 种真菌的系统发育分析、分歧时间估计及基因拷贝数。红色和绿色数字分别表示基因家族的扩张和收缩事件。

重构了灵芝子实体的发育轨迹，发现灵芝酸皮壳层的三层结构由皮壳层外层发育形成，与实际灵芝栽培过程中观察到的皮壳层增厚、分层现象一致，进一步揭示了灵芝酸的合成与灵芝子实体发育之间的内在联系。

图4 灵芝子实体的单细胞转录组及发育轨迹研究

(a) 灵芝子实体细胞类型示意图。(b) 基于高质量细胞基因表达矩阵的 16 个细胞簇的均匀流形近似与投影（UMAP）可视化。每个点代表一个单细胞，颜色表示对应的细胞簇。(c) 代表性细胞类型特异性标记基因的表达模式，颜色表示标准化平均表达量。(d) 子实体中鉴定的 6 种细胞类型簇的 UMAP 可视化，每个点代表一个单细胞，颜色表示对应的细胞类型。(e) 真菌单细胞转录组潜在标记基因的表达模式。(f) 菌壳细胞的连续分化轨迹，每个点代表一个单细胞，黑色箭头指示轨迹的起点和方向。(g) 伪时间上 5 个基因模块显著差异表达基因的热图，a–e 表示具有相似分支表达模式的基因簇。(h) 模块 b 中鉴定基因的差异表达基因（DEGs）GO 富集分析结果的点图。FPKM：每百万映射 reads 中每千碱基转录本的片段数；e 值：多重假设检验调整后的 P 值。

图 5. 已报道的 GA 生物合成基因表达谱及候选催化酶筛选。

(a) 已报道的 GA 生物合成途径基因的热图。热图第一行显示菌肉、菌管和孢子中的单细胞转录组表达水平，第二行展示内菌壳、中菌壳和外菌壳中的表达水平。(b) 菌壳中上调的 CYP450 基因与 GA 生物合成途径基因的 bulk RNA-seq 表达相关性分析。点的颜色强度反映皮尔逊相关系数（r）的强弱，仅显示显著相关的基因（r>0.75）。MVPP：甲羟戊酸 - 5 - 焦磷酸；MPK：甲羟戊酸 - 5 - 磷酸激酶；MVP：甲羟戊酸 - 5 - 磷酸；MK：甲羟戊酸激酶；PMK：磷酸甲羟戊酸激酶；HMGR：3 - 羟基 - 3 - 甲基戊二酰辅酶 A 还原酶；HMG CoA：3 - 羟基 - 3 - 甲基戊二酰辅酶 A；HMGS：3 - 羟基 - 3 - 甲基戊二酰辅酶 A 合酶；AACT：乙酰辅酶 A 乙酰转移酶；IPP：异戊烯焦磷酸；IDI：异戊烯焦磷酸 δ- 异构酶；DMAPP：二甲基烯丙基焦磷酸；FPP：法尼基焦磷酸；SQS：角鲨烯合酶；SE：角鲨烯环氧酶；HLDO：3 - 羟基羊毛甾 - 8,24 - 二烯 - 26 - 醇；HLDA：3 - 羟基羊毛甾 - 8,24 - 二烯 - 26 - 醛。

 结合灵芝酸的空间分布和生物合成关键基因的组织差异性表达特征，鉴定到14个参与灵芝酸生物合成的候选CYP450基因。通过酵母表达体系鉴定到一个新的CYP450基因GlCYP512A3，可以连续两步催化灵芝酸HLDOA生成丹芝酸E和F。其中丹芝酸F是新鉴定的灵芝酸类化合物，体外药理活性证实具有抗癌活性。此外，研究团队实现了羊毛甾醇、灵芝酸中间体HLDOA、丹芝酸E和F等在米曲霉底盘系统中的高效合成（已申请专利）。该研究为灵芝酸药物的开发及绿色生物制造研究提供重要的数据支撑。

图6 灵芝酸生物合成新颖酶CYP512A3的发现及功能研究

 (a) GlCYP512A3 在酵母中的体内功能验证。工程酵母菌株发酵提取物的 LC-MS/MS 分析。(i) 菌株 CK-YT-OCP1；(ii) 菌株 CK-YT-OCP1-LSS-GlCYP5150L8-iGLCPR；(iii) 菌株 YT-OCP1-LSS-GlCYP5150L8-iGLCPR-GlCYP512A3。(b) 底物 GA-HLDOA（m/z 439）的总离子色谱图。(c, d) 图 (a) 和 (e) 中所示化合物 1 和 2 的总离子色谱图。(e) 以 GA-HLDOA 为底物的 GlCYP512A3 体外催化产物的 LC-MS/MS 分析。(i) 空载体 pESC-His 作为阴性对照；(ii) 化合物 1 和化合物 2 通过纯化的丹芝酸E（ganolucidic acid E）和丹芝酸 F（ganolucidic acid F）确认；(iii) 纯化的丹芝酸 F（2）的 LC-MS/MS 分析；(iv) 纯化的丹芝酸 E（1）的 LC-MS/MS 分析；(v) 纯化的 GA-HLDOA 的 LC-MS/MS 分析。(f) GlCYP512A3 催化 GA-HLDOA 生成丹芝酸 E 和丹芝酸 F的推测反应机制。

 原文链接：https://doi.org/10.1016/j.eng.2025.03.030