灵芝活性成分抗肿瘤机制研究进展
概述
据国际癌症研究机构统计显示，2020 年中国癌症发病和死亡数分别占全球总发病和死亡数的23.7%和30.2%，癌症已成为中国居民慢性病主要死亡原因之一。目前晚期癌症治疗的主要手段仍是放化疗，但是其产生的不良反应严重影响患者生活质量，因此临床上迫切需要新型治疗药物应用。中药是中国传统的瑰宝，具有多靶点、多途径，不良反应小等天然优势，临床上已被证实可以作为多种癌症的辅助治疗药物，为临床抗癌药物筛选提供丰富资源。
灵芝为多孔菌目，灵芝科，灵芝属，是真菌赤芝或紫芝的子实体，其味甘能补，性温，具备扶正固本、补益肺气、保肝护肝和镇静安神等功效。灵芝被实验证明具有抗肿瘤活性的成分包括灵芝多糖、灵芝三萜类化合物、甾醇类化合物等。实验研究表明其活性成分在乳腺癌、肺癌、肝癌、宫颈癌、前列腺癌、结直肠癌等均发挥抑瘤作用，其机制涉及抑制肿瘤增殖、侵袭与迁移，诱导肿瘤细胞凋亡和自噬以及参与免疫调控等。
灵芝活性成分
灵芝具有多种活性成分，包括灵芝多糖、灵芝三萜类化合物、甾醇类、生物碱、蛋白质、核苷类等。其中灵芝多糖和灵芝三萜类化合物是主要抗肿瘤活性物质。
·灵芝多糖·
灵芝多糖（GLP）是一种天然聚合体，多糖化学结构的核心是β-葡聚糖，目前研究分析已经分离出了200多种，按照单糖成分差异，将其分为均多糖和杂多糖。均多糖由单一葡萄糖或半乳糖组成，杂多糖则是单一多糖按照不同比例混杂而成。目前研究最广泛的GLP是β-D葡聚糖，α-D葡聚糖，α-D甘露聚糖和多糖蛋白复合体。GLP不易溶于有机溶剂但易溶于水，其常见提取方法包括热水和稀酸碱提取法、酶法、微波提取法、超声波提取法、微波辅助超声波提取法和超声波辅助碱提取法等。GLP的抗癌作用受到灵芝来源、提取方法和多糖类型的影响，目前大多数研究灵芝的生物活性都集中在灵芝的子实体、菌丝体或孢子上。应用不同方法提取的灵芝多糖对癌细胞产生的抑制作用也存在些许差异。
灵芝多糖抗肿瘤作用多有报道，肺癌进行研究发现，水溶性灵芝多糖（WSG）可以通过诱导表皮生长因子受体和人转化生长因子β受体蛋白降解，减少包括ERK1 / 2、FAK、AKT和Smad2 在内的多种细胞因子磷酸化，通过信号通路因子抑制肺部肿瘤生长，减少肺部转移结节的大小。将WSG与顺铂联合给药时发现其有效抑制肿瘤生长和C57BL/6小鼠肺转移结节的形成，同时增强顺铂促凋亡作用，减少其对免疫细胞和正常肺成纤维细胞的细胞毒性。WSG还可以通过调节免疫降低结肠癌的发生和减少肿瘤生长。GLP的免疫调节作用在肝癌治疗上同样有所体现，如通过调节MAPK/NF-κB信号通路促使巨噬细胞向M1极化，提高其吞噬活性和释放一氧化氮来抑制肝癌细胞增殖。另外，GLP是一种有效的自噬抑制剂，可以通过激活MAPK/ERK信号通路抑制自噬体和溶酶体的结合，诱导自噬体在体内积聚，自噬体积聚是GLP诱导结直肠癌细胞凋亡的主要原因。酶水解灵芝多糖（EGLP）可以通过调节凋亡相关基因，诱导结肠癌细胞凋亡。GLP还可以抑制宫颈癌细胞增殖，可能是通过抑制JAK/STAT信号通路和调控凋亡相关基因，如将EGLP作用于U14宫颈癌荷鼠，EGLP可以有效保护小鼠免疫器官降低凋亡抑制基因Bcl-2和COX-2的表达，增强促凋亡基因Bax和Caspase-3的表达。此外GLP还可以调节肿瘤代谢，将GLP与紫杉醇联合应用可以重塑乳腺癌模型小鼠的肠道微生物群，使致癌风险属细菌（脱硫菌属和臭杆菌属）减少，抑制有氧糖酵解相关mRNA表达如葡萄糖转运蛋白3，乳酸脱氢酶A和丙酮酸脱氢酶激酶。GLP对舌鳞癌细胞也起抑制作用，可下调癌症干细胞、上皮间充质转化和药物敏感性标志物。
·灵芝三萜类化合物·
灵芝三萜类化合物（GLTs）是高度氧化的羊毛脂型三萜类化合物，由羊毛脂碳骨架和五环三萜组成，根据其骨架中的碳原子数量及取代基不同可以分为三萜酸、三萜醇、三萜内酯，根据26位取代基不同又可以分为中心三萜类化合物和酸性三萜类化合物，各种三萜类化合物含有大量的荧光素酸。将GLTs应用于荷瘤裸鼠研究发现GLTs组，GLTs联合吉非替尼组的血管抑素、内皮抑素和Bax蛋白表达显著增加，而血管内皮生长因子受体2和Bcl-2蛋白表达降低，证明GLTs可以抑制肺癌balb/c裸鼠的血管生成抑制转移促进肺癌细胞凋亡（Tab.1）。
1 灵芝酸
灵芝酸是灵芝三萜类化合物主要成分之一，在多种癌症中均体现抑制作用。研究表明灵芝酸A（GA-A）/灵芝酸DM（GA-DM）可以抑制间变性脑膜瘤细胞的增殖，通过抑制N-myc 下游调节基因，如Bax、MMP-9 以及信号通路相关p-P13K、p-AKT、p-mTOR 和Wnt-2 蛋白表达，抑制细胞增殖迁移，促进细胞凋亡。GA-A可以通过抑制PI3K/AKT 通路活化，诱导自噬促进凋亡等途径抑制胶质母细胞瘤增殖、迁移和侵袭。GA-A在骨肉瘤、肝癌、乳腺癌细胞中都可起到抑制作用，其过程可能是通过激活调节p53信号通路诱导细胞凋亡。GA-DM通过PI3K/Akt/mTOR通路，靶向抑制自噬和凋亡抑制非小细胞肺癌增殖。灵芝酸D（GA-D）在早期启动和增强自噬信号，而在晚期，损害自噬体-溶酶体融合来阻断自噬通量并抑制溶酶体降解，诱导caspase相关过程介导的细胞凋亡，通过抑制PI3K/AKT信号通路协同凋亡和自噬途径，抑制细胞增殖。
2 其他灵芝三萜类化合物
除灵芝酸外，灵芝三萜中的其他化合物成分对肿瘤也有抑制作用。GLTs中的灵芝醇A可以启动凋亡BCL-2 家族成员诱导结直肠癌细胞凋亡，抑制细胞增殖转移。灵芝醇D可以选择性抑制乳腺癌MCF-7、肝癌HepG2、宫颈癌HeLa、结肠癌Caco-2和HCT-116细胞增殖。荧光醛B（LB）可能是通过诱导G2/M期的细胞周期停滞，诱导活性氧和钙聚集，线粒体凋亡相关蛋白表达上调，抑制Ras/ERK 信号级联，促进细胞凋亡，降低鼻咽癌细胞增殖。从灵芝中提取的中性三萜类化合物（NTF），显著降低了结直肠癌SW620细胞的活力。灵芝三萜类乙醇提取物，可以通过P53/Caspase-3凋亡途径，抑制肺癌A549 和肝癌HepG2细胞增殖。从灵芝子实体中提取的三萜类化合物5-氧代-7α-羊毛脂-9，11（24）-二烯-2-酸甲酯，其对肝癌和宫颈癌细胞有显著抑制作用。
抗肿瘤作用机制
·抑制肿瘤细胞增殖·
细胞增殖旺盛是恶性肿瘤的显著特征，细胞周期包括G1、S、G2、M期。灵芝活性成分可以通过调控细胞周期，抑制肿瘤细胞增殖。细胞周期实验证明含有GLSP的巨噬细胞上清液可以阻断G2/M期的肝癌肿瘤细胞，阻断DNA复制，而单独使用巨噬细胞上清液对肿瘤细胞没有阻断作用。此外从灵芝实体中提取出的褐藻基甘聚糖（FXM）可以通过细胞周期阻滞，抑制黑色素瘤细胞B16-F10细胞增殖。灵芝子实体中提取的三萜类化合物，可以抑制Ras/Raf/MEK/ERK信号，阻断肝癌细胞M期，抑制肝癌细胞增殖。灵芝酸可以靶向NF-κB、RAS-MAPK和PI3K/Akt/mTOR并阻止细胞周期，抑制癌细胞增殖（Tab.2）。
·抑制肿瘤细胞侵袭和转移·
肿瘤的生长需要营养物质，侵袭性肿瘤可以通过血管和淋巴管传播，肿瘤的浸润和转移与细胞黏附分子、细胞外基质、上皮-间质转化及肿瘤血管生成等密切相关。肿瘤细胞本身及巨噬细胞能产生血管生成因子，如血管内皮生长因子（VEGF），诱导新生血管生成，促进其自身增殖。研究表明RAS、MYC、MAPK信号通路可影响血管生成。GLP可能通过抑制血管内皮细胞的增殖和血小板内皮细胞黏附分子-1（PECAM-1）、血管内皮细胞生长因子A（VEGFA）和成纤维细胞生长因子2（FGF-2）的产生来抑制血管生成，从而抑制远端肿瘤的生长。GDNB以剂量依赖性降低肺癌细胞中的间充质标志蛋白（N-cadherin、波形蛋白和Snail）水平，并增加了上皮标志蛋白（E-cadherin）的水平，表明其可以肺癌细胞的侵袭、迁移和上皮-间充质转化。将GLTs应用于荷瘤裸鼠研究发现GLTs 组，GLTs联合吉非替尼组的血管抑素、内皮抑素蛋白表达显著增加，而血管内皮生长因子受体2表达降低，证明GLTs 可以抑制肺癌balb/c裸鼠的血管生成抑制转移。
·诱导肿瘤细胞凋亡和自噬·
1 细胞凋亡
细胞凋亡是细胞自主性程序性死亡。细胞凋亡受复杂的分子机制调控，主要通过促凋亡因子（caspase 家族、BCL-2 家族中的Bax、线粒体促凋亡蛋白）和抗凋亡因子（如BCL-2家族中Bcl-xL 等）的复杂调控。灵芝中多种活性成分可以通过抑制凋亡调控肿瘤细胞增殖。GLP5可以通过激活细胞凋亡途径抑制白血病细胞增殖。EGLP可以降低凋亡抑制基因Bcl-2和COX-2，增强促凋亡基因Bax和Caspase-3的表达，抑制U14小鼠体内宫颈癌细胞增殖。灵芝酸可以与膜受体酪氨酸激酶（RTK）相互作用，如灵芝酸与IR、IGFR-1、IGFR-2、VEGFR-1、VEFGR-2和EGFR相关的信号网络相互作用并调节，参与癌症信号通路。富含多糖和三萜类化合物的灵芝提取物可以通过抑制PI3K/mTORC2/Akt信号通路和AMPK/ mTORC1信号通路诱导肺癌细胞凋亡。应用GLP和顺铂联合给药发现，宫颈癌细胞Bax表达增加，Bcl-14表达显著降低，通过诱导凋亡抑制宫颈癌细胞增殖。
2 自噬
自噬和凋亡有着相似的刺激因素和调节蛋白，可以通过诱导凋亡引起细胞死亡。自噬可以形成自噬溶酶体降解所包裹的物质。通过体内外实验表明，GLP可诱导结直肠癌自噬的启动，用自噬双标慢病毒转染确定了GLP 通过阻断自噬体和溶酶体融合，阻断细胞中的自噬通量，诱导自噬体积累，触发细胞凋亡，其机制是通过MAPK/ERK 信号通路促使溶酶体酸化和溶酶体组织蛋白酶活性降低所致。将RSGLP应用于胃癌AGS 细胞时发现，BSGLP诱导自噬破坏自噬通量，这一结果通过晚期自噬抑制剂氯喹和早期自噬诱导剂雷帕霉素联合处理AGS细胞得到进一步验证。GA-DM通过PI3K/Akt/mTOR通路，靶向抑制自噬，促进自噬通量，抑制肺癌细胞增殖。
·免疫调节作用·
免疫调节与抗肿瘤作用休戚相关，机体的抗肿瘤免疫反应主要是通过细胞免疫，如自然杀伤细胞、巨噬细胞、髓源性抑制细胞、细胞毒性T细胞等发挥作用。肿瘤自身对免疫有抑制作用，其中肿瘤微环境有助于肿瘤细胞逃避免疫追踪，促进自身增殖，因此现代临床治疗会采用免疫治疗手段，提高免疫系统对肿瘤细胞抑制。灵芝多糖和三萜类化合物可以通过调节几种类型的癌症相关免疫组成来帮助癌症免疫治疗。
1 巨噬细胞
巨噬细胞（M）是人体天然免疫系统中的重要免疫细胞，主要通过效应分子的产生和吞噬作用抑制肿瘤细胞增殖。M1型巨噬细胞是抑制肿瘤增殖的主要细胞，其通过Th1型细胞激活起到免疫抑制，M2型巨噬细胞可以促进肿瘤血管生成，推进肿瘤进展，在Th2型细胞诱导下激活，起到抑制自然杀伤细胞和T细胞活化增殖的作用。灵芝活性成分可以促进巨噬细胞向M1型极化。GLSP通过激活巨噬细胞重塑肿瘤微环境，促进原代巨噬细胞极化为M1型，促进各种炎症因子和细胞因子的分泌，抑肝癌细胞增殖，其机制可能涉及MAPK和NF-κB信号通路激活。灵芝活性成分可以通过释放细胞因子抑制肿瘤细胞增殖。GLP可能通过激活骨髓来源的巨噬细胞促进IL-1、IL-68β和TNF-α等细胞因子的分泌，增强机体免疫功能，从而抑制远端肿瘤的生长。
2 髓源性抑制细胞
髓源性抑制细胞（MDSC）是免疫应答的主要抑制因素，阻碍免疫治疗，MDSCs在健康个体中迅速分化为成熟的树突状细胞、巨噬细胞或粒细胞，在病理情况下中会累积。通过体内实验研究证明25和100mg/kg GLP给药可以抑制MDSCs积累，抑制肿瘤增殖。
3 自然杀伤细胞
自然杀伤细胞是不受抗原特异性调控的淋巴细胞，是人体抵抗肿瘤细胞和病毒的基础防线，可以快速识别和清楚感染细胞。通过体外脾自然杀伤实验分析发现灵芝孢子粗多糖（CPGS）可以促进自然杀伤细胞的肿瘤杀伤能力。将GLP 应用于荷肝瘤小鼠，发现其可以减少小鼠体内自然杀伤细胞分泌的IL-13对肿瘤免疫监视的抑制作用，通过免疫调节肝癌细胞增殖。
4 CD4+/CD8+T细胞
T细胞根据细胞表面分化抗原（CD）的差异增殖并分化成若干亚群，CD4+和CD8+T细胞是T细胞功能的两个不同亚群，CD4+T可以分化为1 型辅助性T细胞（Th1）、2 型辅助性T细胞（Th2）等功能亚群，在机体免疫中起到辅助和诱导作用。CD8+T细胞主要功能亚群是细胞毒性T细胞（CTL），起到破坏病毒感染细胞与肿瘤细胞的作用，两者相互平衡维持机体的免疫平衡。其中Th1细胞分泌TNF-α等细胞因子有助于产生CTL，在抗肿瘤免疫中发挥重要作用。通过体内实验证明GLP可以通过激活NF-κB 信号通路，促进细胞间黏附因子1（ICAM-1）的表达，增强T淋巴细胞向黑色素瘤的浸润，与肿瘤免疫起协同作用。灵芝孢子精制多糖（RPGS），能增加胸腺中幼稚T细胞的比例，提高外周血中T细胞和CD8+T细胞亚群的比例，共刺激因子CD28的表达促进T细胞活化。GLP可以增加CD4++和CD8+T淋巴细胞的比例，促使其分泌Th1型细胞因子（IFN-γ 和IL-12）以增强免疫增强活性。
总结与展望
近年来随着生活节奏逐渐改变，恶性肿瘤的发病率及死亡率呈逐年上升趋势，其晚期患者的治疗仍是手术、放疗、化疗为主。治疗带来的不良反应给患者的心理和健康带来巨大压力。
灵芝是中国传统药食同源中药，目前研究已经证明灵芝活性成分在乳腺癌、肺癌、胃癌、宫颈癌、结直肠癌等恶性肿瘤中发挥显著抑瘤作用，且已有灵芝活性成分相关药物应用于临床减轻患者放化疗术后的不良反应。可见灵芝在临床癌症辅助治疗方面有可用前景（Fig.1）。本文结合国内外文献对灵芝方面的研究总结有以下几点：（1）对于灵芝活性成分的研究多集中在灵芝多糖和灵芝三萜类成分，灵芝抑瘤作用的药物分子机制仍需深入；（2）灵芝具有多靶点，其治疗作用在机制上体现应是多方面多途径探讨，对抑瘤机制的研究应更深入探讨；（3）结合现代科学技术、生物信息学分析、分子生物学分析等将灵芝活性成分靶点与疾病对接，有助于阐明灵芝中各个成分抑瘤作用的机制；（4）将灵芝与西药结合，探讨灵芝作为癌症辅助治疗药物在针对化疗药物不良反应上的作用有望在临床上减轻癌症晚期患者痛苦，提高患者生存质量。
参考资料：
[1]吕俞娇，周姝婷，王丽娜，等．灵芝活性成分抗肿瘤机制研究进展[J/OL]．中国临床药理学与治疗学中国药理学会主办.
