帕金森病是中老年人常见的神经退行性疾病之一，也是中老年人最常见的运动功能障碍性疾病，其主要病理特点为黑质纹状体通路的多巴胺能神经元发生退行性病变减少和死亡，使神经递质多巴胺水平下降，主要临床表现为运动功能障碍，包括静止性震颤、运动迟缓、肌张力增高和姿势不稳等。目前治疗帕金森病的药物大多通过增加脑内多巴胺水平或模拟多巴胺效应来控制症状，但长期服用存在较大的不良反应，并在使用一定时间后会出现疗效减退及远期副作用。

我国传统中药灵芝，被历代医药家尊为“滋补强壮、扶正固本”的神奇珍品，对人体具有双向调节作用，涉及心脑血管、消化、神经、内分泌、呼吸、运动等系统，尤其对肿瘤、肝脏病变、失眠、衰老的防治作用最为显著。研究发现，灵芝多糖的抗氧化作用，可以减轻神经毒素对多巴胺能神经元的损伤。

本研究将采用小鼠神经瘤细胞neuro-2a，通过多巴胺能特异性神经毒素MPP+损伤，抑制线粒体复合物I，观察灵芝提取物对MPP+ 损伤线粒体功能的影响，并从细胞凋亡的角度探究灵芝可能发挥的作用机制。

灵芝提取物的作用

灵芝提取物对MPP+诱导neuro-2a 细胞活性的影响与正常组比较，模型组neuro-2a 细胞活性降低( P＜ 0. 01) ；与模型组比较，800 μg /mL 灵芝提取物组neuro-2a 细胞活性升高( P ＜ 0. 05) ，见图1。提示灵芝提取物能够提高MPP+诱导的neuro-2a 细胞活性。

灵芝提取物对MPP+ 诱导的neuro-2a 细胞线粒体膜电位的影响正常组除极少数细胞被染绿色外，红色荧光几乎布满整个视野，表明正常细胞线粒体膜电位较高，JC-1以聚合物的形式存在于线粒体膜内，红色荧光多且亮; 与正常组比较，模型组neuro-2a 细胞JC-1 从线粒体内释放，浓度降低，逆转为发射绿色荧光的单体形式，线粒体跨膜电位去极化，并且随着损伤时间的延长，红色荧光逐渐减少，绿色荧光逐渐增加，最终几乎全部细胞都被染为绿色，表明线粒体膜电位降低，线粒体遭到严重破坏; 与模型组比较，灵芝提取物组neuro-2a 细胞线粒体膜电位水平升高，表现为红色荧光的增加和绿色荧光的减少，见图2。提示灵芝提取物可以增加MPP+ 诱导的neur-2a 细胞线粒体膜电位。

灵芝提取物对MPP+ 诱导的neuro-2a 细胞线粒体色素C 的影响正常组细胞内细胞色素C 的绿色荧光与标记线粒体的红色荧光基本重叠，表明细胞色素C 与线粒体共定位；模型组细胞内细胞色素C 的绿色荧光呈弥散状态，与线粒体红色荧光不能共定位，表明细胞色素C 从线粒体释放；灵芝提取物组细胞内这种“不共定位”的情况有所改善，见图3。提示MPP+可以诱导neuro-2a 细胞产生凋亡反应，并且灵芝提取物可以抑制MPP+ 诱导的细胞色素C从线粒体的释放。

灵芝提取物对MPP+ 诱导的neuro-2a 细胞cleavedcaspase-3/pro-caspase-3、cleaved-caspase-9/pro-caspase-9 表达的影响与正常组比较，模型组neuro-2a 细胞cleavedcaspase-3/pro-caspase-3、cleaved-caspase-9/pro-caspase-9 表达升高( P＜0. 01) ; 与模型组比较，灵芝提取物组neuro-2a细胞cleaved-caspase-3/pro-caspase-3、cleaved-caspase-9/procaspase-9 表达降低( P＜0. 01) ，见图4。

MPP+能造成线粒体损伤，因此本研究选用MPP+ 诱导的细胞凋亡。ATP 的合成是线粒体功能的核心，起着至关重要的作用，特别是线粒体的产生及其生理功能在调节神经递质的传递以及维持突触可塑性方面尤为重要。帕金森病患者脑中多巴胺能神经元细胞的丢失程度与这些细胞组中caspase-3 阳性神经元的百分比呈正相关，这种关联在帕金森病动物模型中亦可观察到，这表明表达caspase-3 的神经元比那些不表达的神经元对病理损伤过程更敏感。另外，电子显微镜观察表明，caspase-3 激活先于帕金森病并且不是帕金森病中凋亡细胞死亡的结果。

细胞凋亡是导致黑质纹状体多巴胺能神经元丢失的主要原因，与自噬对细胞存活的双向调节作用不同，凋亡对细胞死亡的调节是单向性的，它能及时主动清除机体衰老及异常细胞发挥清道夫作用。MPP+ 作用后，引起caspase-3、caspase-9 活化，表现为活化亚基水平升高，因此，初步判断caspase 家族在MPP+ 介导的细胞凋亡过程中起着重要作用，其中caspase-3 为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。caspase-3 正常以酶原( 32 kDa) 的形式存在于胞浆中，在凋亡早期阶段被激活，活化的caspase-3 由2 个大亚基( 17 kDa) 和2 个小亚基( 12 kDa) 组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。本研究通过采用MPP+损伤线粒体，导致细胞内线粒体膜电位下降和细胞色素C 释放，从而促进caspase 通路介导的细胞凋亡。使用灵芝提取物干预后，不同程度、不同方面减轻了线粒体损伤，从而抑制了细胞凋亡，可能对于提高多巴胺能神经元生存率或者改善微环境具有特殊的意义，也对于灵芝今后在帕金森病的应用和开发利用有着一定的借鉴作用。

参考文献：黄茜， 任志丽. 灵芝提取物对帕金森病模型细胞凋亡的保护作用[J].《中成药》，2022,44（6）：1973-1976.