文献分享｜真菌多糖的糖苷键结构对其在小鼠体内抗炎活性的影响

【文章信息】

• 发表时间：2025年1月
• 期刊：Journal of Advanced Research（高级研究杂志）
• 影响因子：IF=11.4
• 最高JCR分区/中科院分区：Q1 多学科科学，综合性期刊1区
• 题目：Glycosidic linkages of fungus polysaccharides influence the anti-inflammatory activity in mice
• DOI：https://doi.org/10.1016/j.jare.2024.01.037

 

 

【研究亮点】

• 从竹荪（DIP）和银耳（TFP）中提取并纯化了两种具有不同糖苷键结构的真菌多糖。
• DIP和TFP通过依赖肠道菌群的方式缓解了小鼠结肠炎。
• 由1,3-β-D-葡聚糖主链及β-1,4-和β-1,6-连接的葡聚糖支链组成的DIP，相较于TFP表现出更优的抗炎活性。
•  糖苷键结构在真菌多糖的抗炎活性中起关键作用。

 

 

【研究背景】

作为天然生物活性大分子，多糖不仅来源广泛，还因其广泛的健康益处而被应用，例如抗炎、抗糖尿病、抗氧化和抗肿瘤作用，尤其是对肠道菌群的双向调节作用。天然多糖具有复杂的结构，如果胶、葡聚糖、木葡聚糖、葡甘露聚糖、甘露聚糖、半乳甘露聚糖和果聚糖。此外，多糖的理化特性，包括特定的糖苷键、分支频率、分子量和链构象，已知会影响其生物活性。

 

过去几十年中，从植物、动物、真菌和海藻等多种天然资源中分离的多糖已显示出广泛的药理活性。同时，这些生物活性多糖的“来源-功能”关系也逐渐被研究，但目前仍不清楚明确的结构如何促成多糖的生物活性。探索多糖的结构-功能关系可以更深入地理解其潜在功能。由于多糖结构的复杂性，研究其结构-功能关系的一种策略是聚焦于决定多糖结构多样性的单一因素，例如单糖组成、糖苷键、分支度或分子量。在这些因素中，糖苷键（即多糖链中糖单元之间的连接类型）对多糖链的局部构象至关重要，进而影响其空间形态和生物活性。例如，α-(1,4)-D-半乳糖醛酸键对枸杞多糖促进巨噬细胞功能的作用具有影响，而主要通过α-(1→3)糖苷键连接的褐藻多糖在羊栖菜多糖中表现出最强的生物活性。

 

竹荪（Dictyophora indusiata）和银耳（Tremella fuciformis）是兼具食用与药用价值的珍稀真菌。许多研究表明，竹荪多糖（DIP）和银耳多糖（TFP）具有显著的抗炎活性，表现为调节炎性细胞因子、恢复肠道屏障完整性及调控肠道菌群。DIP与TFP在结构上存在显著差异。前期研究表明，DIP由1,3-β-D-葡聚糖主链及1,6-β-D-Glcp支链组成，而TFP则由1,3-α-D-甘露糖主链及部分D-木糖、D-甘露糖、L-岩藻糖和D-葡萄糖醛酸支链构成。我们假设真菌多糖的糖苷键会选择性调控其抗炎活性。因此，DIP与TFP的糖苷键差异为解析真菌多糖的结构-功能关系提供了线索。

 

本研究通过比较DIP与TFP的抗炎活性，探索真菌多糖的结构-功能关系。首先从竹荪和银耳中纯化DIP与TFP，并通过分子量测定、分子形态分析、甲基化分析和核磁共振（NMR）分析明确其结构。随后，采用DSS诱导的结肠炎小鼠模型评估DIP与TFP的抗炎效果，并分析结肠炎症状、组织形态、肠道炎性因子以及治疗前后肠道菌群的结构与功能。

 

【研究结果】

1. 具有不同糖苷键的DIP与TFP的制备与表征

多糖的化学性质对其药理学特性具有关键作用。如SEC-RID色谱图所示（图1B），DIP和TFP均呈现单一对称峰，表明所含多糖为均一组分。DIP和TFP的分子量分别为1.21 × 10⁶ Da和1.93 × 10⁶ Da。这些结果与先前研究一致，表明从竹荪（D. indusiata）和银耳（T. fuciformis）中提取的多糖具有较高的分子量。此外，DIP和TFP的多分散指数分别为1.238和1.331，表明其均一性较高。DIP和TFP中总多糖含量分别为90.52%和85.07%，证明两者纯度较高。

通过扫描电子显微镜（SEM）观察DIP和TFP的形态特性（图1C）。值得注意的是，两者的微观结构存在显著差异：DIP表面粗糙且存在大量孔洞，而TFP表面平坦光滑并具有明显孔隙。

为进一步阐明DIP与TFP的结构特征，通过GC-MS进行甲基化分析。DIP和TFP的糖苷键存在显著差异（图1D）。DIP的PMAAs（部分甲基化醛醇乙酸酯）显示四个主要峰，GC-MS分析表明其包含2,3,4,6-四-O-甲基葡萄糖、2,4,6-三-O-甲基葡萄糖、2,6-二-O-甲基葡萄糖和2,4-二-O-甲基葡萄糖，表明DIP主要由末端葡萄糖（T-Glcp）、1,3-连接的葡萄糖（1,3-linked-Glcp）、1,3,4-连接的葡萄糖（1,3,4-linked-Glcp）和1,3,6-连接的葡萄糖（1,3,6-linked-Glcp）组成，摩尔比为3.39:2.15:1.00:1.60。相比之下，TFP的PMAAs显示四个主要衍生物：2,3,4-三-O-甲基岩藻糖、3,4-二-O-甲基木糖、2,4,6-三-O-甲基甘露糖和4,6-二-O-甲基甘露糖，表明TFP主要由末端岩藻糖（T-Fucp）、1,2-连接的木糖（1,2-linked-Xylp）、1,3-连接的甘露糖（1,3-linked-Manp）和1,2,3-连接的甘露糖（1,2,3-linked-Manp）构成。

¹H NMR谱进一步验证了DIP和TFP的详细结构（图1E）。DIP中4.52 ppm的信号对应1,3-β-D-葡萄糖和1,3,6-β-D-葡萄糖的H-1；4.21 ppm的信号对应末端β-D-葡萄糖的H-1。TFP中4.44、5.04、5.10和5.47 ppm的信号分别对应1,2-β-D-木糖、1,2,3-α-D-甘露糖、1,3-α-D-甘露糖和末端α-L-岩藻糖的H-1。综合甲基化与NMR分析结果，DIP为1,3-β-D-葡聚糖主链，含1,4-和1,6-连接的葡萄糖支链；TFP为线性1,3-α-D-甘露糖主链，含D-木糖和L-岩藻糖支链。

 

图1 DIP和TFP的提取与表征。

（A）DIP和TFP的制备流程及示意图结构。（B）通过SEC-MALLS-RID测定DIP和TFP的分子量分布。（C）DIP和TFP的代表性SEM图像（×1,000）。（D）DIP和TFP甲基化分析的总离子色谱图。（E）DIP和TFP的1H NMR谱图

 

2. DIP在改善DSS诱导的结肠炎中表现出优于TFP的治疗效果

为比较DIP与TFP的抗炎作用，建立了DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型。实验设计示意图如图2A所示。在DSS组中，观察到体重下降、疾病活动指数（DAI）评分升高及结肠缩短（图2B-E）。值得注意的是，DIP、TFP和5-ASA（5-氨基水杨酸）可有效缓解上述症状。此外，与5-ASA和TFP组相比，DIP显著减轻了体重下降、降低了DAI评分，并增加了结肠平均长度。

通过苏木精-伊红（H&E）染色评估结肠黏膜损伤。如图2F所示，DSS组表现出明显的黏膜损伤、隐窝缺失、广泛炎症浸润、杯状细胞破坏及较高的组织学评分（图2I）。过碘酸-希夫（PAS）染色图像显示结肠炎小鼠结肠组织中杯状细胞严重凋亡（图2G）。此外，结肠组织持续炎症通常发展为肠道结构纤维化。相应的天狼星红（PSR）染色表明，DSS组结肠纤维化面积最大（图2H）。然而，5-ASA、DIP和TFP治疗可减轻这些症状。通过ImageJ进行的定量分析进一步验证了上述结果（图2I-K）。具体而言，根据H&E、PAS和PSR染色的组织学评分，DIP组的评分低于TFP组，但两组间差异无统计学意义。这些结果表明，DIP对结肠炎小鼠的保护作用优于TFP。

 

图2 DIP和TFP缓解了DSS诱导的小鼠急性结肠炎。

（A） 治疗方案示意图。（B）体重变化。（C）疾病活动指数（DAI）评分。（D）结肠形态。（E）平均结肠长度（n = 5）。使用（F）H&E染色、（G）PAS染色和（H）PSR染色的结肠切片组织学表现。定量分析显示在（I）H&E切片的组织病理学评分、（J）PAS阳性区域百分比以及（K）纤维化区域统计（n = 3）

 

3. DIP与TFP调控结肠炎性细胞因子水平并恢复肠道屏障功能

细胞因子在溃疡性结肠炎的发病机制中起关键作用，影响炎症反应的多个方面。通过测定IL-10、IL-6、IL-1β和IL-17A的水平，探讨了TFP和DIP对细胞因子表达的差异性影响。IL-10是一种重要的抗炎介质，已在先前研究中被广泛研究。如图3A所示，DSS组中IL-10的降低在补充DIP和TFP后有所增加。此外，如图3B-D所示，DSS处理显著提高了IL-1β、IL-6和IL-17A的表达水平，而DIP和TFP能有效降低这些表达水平，尤其是在DIP组中。溃疡性结肠炎的重要治疗策略是减少促炎细胞因子和/或增加抗炎细胞因子。因此，DIP和TFP通过调节细胞因子水平能够抑制结肠炎小鼠的病理炎症。特别是，与TFP相比，DIP表现出更优的抗炎活性。

被破坏的上皮屏障和增加的细胞旁通透性是溃疡性结肠炎的诱因。肠道紧密连接蛋白（occludin-1和ZO-1）在肠道屏障功能中起关键作用。通过免疫荧光法检测occludin-1和ZO-1的水平。免疫荧光染色显示，与DSS组相比，DIP和TFP显著增加了occludin-1（绿色荧光）和ZO-1（红色荧光）的水平（图3E）。为进一步评估肠道通透性，我们测定了口服FITC-葡聚糖后血清中的荧光强度。与DSS组相比，经5-ASA、DIP和TFP处理的小鼠血清荧光强度显著降低（图3F），表明肠道通透性得到恢复。这些结果表明，DIP和TFP有效保护了结肠炎小鼠的肠道上皮。

 

图3 DIP与TFP调控结肠炎性细胞因子水平并恢复肠道屏障功能。

（A）结肠组织中IL-10的水平（n = 5）。（B）结肠组织中IL-1β的水平（n = 5）。（C）结肠组织中IL-6的水平（n = 5）。（D）结肠组织中IL-17A的水平（n = 5）。（E）结肠组织中occludin-1（绿色荧光）和ZO-1（红色荧光）的表达；比例尺为100微米。（F）血清中FITC-葡聚糖浓度（n = 3）

 

4. DIP和TFP以肠道微生物群依赖性的方式改善了小鼠的结肠炎

DIP和TFP以肠道微生物群依赖性的方式改善了小鼠的结肠炎。为了确定DIP和TFP对缓解溃疡性结肠炎的影响是否依赖于肠道细菌的存在，我们用抗生素混合剂处理结肠炎小鼠以耗竭肠道微生物群。治疗方案如图 4A 所示。抗生素治疗后，小鼠的体重、DAI 评分和结肠长度等指标未观察到显著变化（图 4B-E）。与 Abs + DSS 组相比，多糖处理组（Abs + DSS + DIP、Abs + DSS + TFP）并未显著改善结肠炎症状，表现为体重（图 4B）、DAI 评分（图 4C）和结肠长度（图 4D-E）相似。此外，所有组（Abs + DSS、Abs + DSS + DIP、Abs + DSS + TFP）的 H&E 染色显示，隐窝破坏、炎症浸润和杯状细胞减少（图 4F）。如图 4G 所示，各组的血清FITC-葡聚糖水平无显著差异，表明在抗生素处理后，DIP和TFP未恢复结肠炎小鼠的肠道通透性。此外，结肠组织中IL-10、IL-17A和IL-1b水平的评估（图4H-J）显示，由于肠道微生物群的耗竭，DIP和TFP的抗炎效果被取消。这些结果表明，多糖组通过调节肠道微生物群改善了结肠炎小鼠的状况。

 

图4 肠道菌群对DIP和TFP在DSS诱导的结肠炎中的治疗效果至关重要。

（A）实验治疗时间表示意图。所有四组小鼠在第0-4天和第8-10天接受广谱口服抗生素（Abs）预处理（包括万古霉素30 mg/kg、甲硝唑60 mg/kg、硫酸新霉素60 mg/kg和氨苄西林60 mg/kg）。随后，在第4-8天和第10-12天给予2.5% DSS水。（B）体重变化。（C）疾病活动指数（DAI）评分。（D）结肠形态。（E）结肠平均长度。（F）苏木精-伊红（H&E）染色。（G）血清中FITC-葡聚糖浓度（n=3）。（H）IL-10、（I）IL-17A和（J）IL-1β水平（n=5）。数据以均值±标准差表示。显著性水平标注为：p < 0.05，p < 0.01，p < 0.001，“ns”表示无统计学差异。

 

5. DIP和TFP调节肠道菌群的组成

DIP和TFP调节了肠道微生物群的组成。如主坐标分析（PCoA）图所示，与DSS组相比，多糖处理小鼠的肠道细菌组成具有不同的特征（图 5A）。为了进一步识别五个不同组中的共有和特有分类群，进行了维恩图分析（图 5B）。随后分析了肠道微生物群在门和属水平的结构。研究数据显示，在 DSS 组中，与对照组相比变形菌门的比例显著增加，表明 DSS 处理破坏了肠道微生物群的平衡。在用5-ASA、DIP和TFP处理后，结肠炎小鼠中变形菌门的丰度显著降低。进一步的详细分析，如群落条形图（图 5D）和热图显示了在属水平的微生物比例。这些分析表明 DIP 和 TFP 均可调节结肠炎小鼠的肠道微生物群结构。结果表明，DIP 处理显著增加了 norank_f__Muribaculaceae、norank_f__norank_o__Clostridia_UCG-014 和 Faecalibaculum 在结肠炎小鼠中的比例。有研究表明，Faecalibaculum 的相对丰度降低反复被证明是溃疡性结肠炎患者微生物群组成失衡的一个特征。特别地，在 DIP 组中 Faecalibaculum 占比超过 20%，其已被证实具有抗炎作用，这或许可以解释 DIP 组相较于 TFP 组具有更强的抗炎效果。此外，在口服 5-ASA、DIP 和 TFP 后，由 DSS 诱导增加的 Escherichia-Shigella 的相对丰度可被显著降低。据报道，Escherichia-Shigella 在结肠炎小鼠和克罗恩病患者中有所扩张。综上所述，DIP 能够通过重塑肠道微生物群的组成，更优地改善小鼠的结肠炎状况。

 

图5 DIP和TFP调节肠道菌群的组成。

（A）基于OTU水平的PCoA分析。（B）OTU水平的Venn图。（C）门水平的肠道菌群相对丰度。（D）属水平的条形图。数据以均值表示，每组n=4只小鼠。

 

6. DIP和TFP改变了肠道菌群的功能

DIP和TFP改变了肠道微生物群的功能。基于KEGG酶的PCA图明显区分了三组（图 6A）。LEfSe分析进一步揭示了DSS、DIP和TFP组之间不同的代谢途径富集情况。与DSS和TFP组相比，DIP组显著富集了氨基酸代谢（图 6B）。氨基酸在肠道微生物群的蛋白质合成和分解过程中发挥重要作用。先前的研究也表明，氨基酸代谢是结肠炎小鼠中最显著的变化之一。基于此结果，我们进一步确定了氨基酸代谢的详细功能差异（图 6C）。与其它组相比，DIP 组中色氨酸代谢（Ko00380）明显富集。重要的是，结肠炎小鼠可能与肠道微生物群的色氨酸代谢效率低下有关。肠道微生物群通过分解色氨酸可以介导免疫系统激活和肠道屏障损伤。通过调节色氨酸代谢，多糖可以改善结肠炎小鼠的状况。碳水化合物可以通过特定的 CAZymes 被分解成形式，使肠道微生物群将其作为能量来源。如图6D所示，糖苷水解酶（GHs）是这三组之间主要的差异CAZymes。我们进一步对DSS、DIP和TFP组中前20名GH家族进行了比较交互分析（图 6E）。GHs可以催化糖分子之间糖苷键的水解，以降解和代谢碳水化合物。先前的研究表明，能够作用于多糖的CAZymes的丰度在多糖处理组中应该增加。与DSS和TFP组相比，DIP组显著富集了GH1家族。GH1是一个包括β-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21）、外切 β-1,4-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.74）、β-糖苷酶（EC 3.2.1.-）的糖苷水解酶家族。此外，GH3也在DIP组中被鉴定出来，包含诸如 β-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21）、葡萄糖苷酶1,3-β-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.58）和葡萄糖苷酶 1,4-β-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.74）等酶。另一方面，GH29 家族，包含甘露聚糖β-1,3-甘露糖苷酶（EC 3.2.1.-）、α-甘露糖苷酶（EC 3.2.1.24）和 α-1,3-甘露糖苷酶（EC 3.2.1.-），可能水解TFP中的 α-1,3-连接甘露糖。此外，GH29 家族，主要由 α-L-岩藻糖苷酶（EC 3.2.1.51）组成，可能靶向TFP中L-岩藻糖残基的糖苷键。由于DIP和TFP的糖苷键不同，它们可以被特定的CAZymes降解，这进一步影响了肠道微生物群的丰度和代谢产物的生成，从而导致在结肠炎小鼠中不同的疗效。此外，多糖越复杂，分解它所需的酶就越多。与含有不同单糖（杂多糖）和更多连接类型的 TFP 相比，DIP 中的 β-葡聚糖结构更简单 ，可以被更少的酶降解。因此，一种生物体的降解产物可以通过底物和代谢交叉喂养作为另一种生物体的碳源，从而调节肠道微生物群。

 

图6 基于宏基因组分析的DIP和TFP对DSS处理小鼠肠道菌群功能基因的调控作用（n=4）。

（A）基于KEGG通路的PCA图。（B）KEGG通路在第二层级（功能分类）的LEfSe分析，展示差异丰度代谢通路。（C）第二层级的氨基酸代谢通路分析。（D）CAZymes（碳水化合物活性酶）差异丰度的热图。（E）前20种糖苷水解酶（GHs）的环形分布图。（F）DIP和TFP通过糖苷水解酶（GHs）进行水解的可能模式示意图。

 

【结论】

在本研究中，提取并鉴定出DIP和TFP为同质多糖。DIP以1,3-β-D-葡聚糖为骨架，带有1,4-β和1,6-β-D-葡聚糖支链，而TFP则是1,3-α-D-甘露聚糖，其支链含有D-木糖和L-岩藻糖。体内研究显示，DIP和TFP均可减轻结肠炎小鼠的体重减轻、结肠缩短和组织病理损伤，恢复肠道上皮屏障，并调节炎症细胞因子。值得注意的是，DIP在缓解结肠炎相关症状方面较TFP发挥了更强的效果。此外，DIP和TFP对结肠炎的疗效均依赖于肠道微生物群。DIP增加了有益菌的丰度，包括norank_f__Muribaculaceae、norank_f__norank_o__Clostridia_UCG-014和Faecalibaculum。宏基因组分析还表明，DIP 和 TFP 部分逆转了DSS诱导的细菌功能变化。氨基酸代谢和色氨酸代谢（Ko00380）途径可能在DIP改善结肠炎中发挥关键作用。在DIP组中，GH1和GH3被鉴定参与水解DIP中的葡萄糖糖苷键。同样，GH92和GH29家族被预测可水解TFP中α-1,3-连接的甘露糖和L-岩藻糖残基的糖苷键。总体而言，我们的研究结果突出了糖苷键在食用菌多糖抗炎活性中的关键作用。