皂苷（越南参皂苷R13-、三七皂苷J-、西洋参皂苷L16-是二/三醇型皂苷），具有广泛的生物活性，对心脑血管、抗肿瘤、神经和免疫系统等方面作用独特且具有潜在的多种活性。因其结构复杂，目前不能化学合成，需要从三七、人参、越南参、绞股蓝等植物中提取获得，但植物中含量较低，且植物资源有限。为此，利用有限的人参二/三醇型人参皂苷获得大量越南参皂苷R13-、三七皂苷J-、西洋参皂苷L16-方法更为可行简便。

▲图源：网络

目前，常用的生物转化三七总皂苷获得越南参皂苷R13-、三七皂苷J-、西洋参皂苷L16-的方法多为微生物发酵或提取微生物粗酶法对皂苷骨架支链结构进行烯基氧化和糖水解，获得皂苷结构的改变。微生物发酵法的菌株来源相对复杂，筛选具有活性或高活性的菌株相对难度大、筛选成功率低、通常选择几百株菌才可筛选出几株有皂苷转化活性的菌株，转化率不高且转化过程及转化产物种类相对复杂；提取微生物粗酶法，转化特异性高，条件温和，无需微生物发酵所需的培养基，产物目标性明确且不会产生微生物自身的次级代谢产物，但是由于酶的蛋白质属性，导致从微生物中提取分离纯化有皂苷转化活性的酶难度大，纯化后的酶需要溶解在缓冲液中保持酶活力，同时酶回收较困难等一系列问题。所以获得一种高皂苷转化活性，特异性强，次生产物少的菌株发酵和粗酶转化方法对于获得工业化生产皂苷越南参皂苷R13-、三七皂苷J-、西洋参皂苷L16-十分重要。

为了提高皂苷越南参皂苷R13-、三七皂苷J-、西洋参皂苷L16-的含量，解决微生物发酵法和粗酶转化三七总皂苷获得三七皂苷转化率低的不足，昆明理工大学研究团队提出了一种炭角目菌植物内生菌及应用。

研究团队首先对菌株进行了分离与鉴定。选取植物组织，流水冲洗晾干，用乙醇浸泡1min，NaCLO浸泡3min，然后用蒸馏水漂洗3次，切成小块。用无菌镊子将其铺于PDB培养基，培养3～5天，挑取菌丝至新制PDB培养基，经几次纯化后得内生真菌，斜面4℃保存备用。菌体呈杆状，单个菌落培养3天直径约为0.7-0.9cm×1.02.0cm。菌落白色，圆形，微凸，边缘整齐。采用分子鉴定，克隆真菌核糖体rDNA基因转录间隔序列（ITS1-5.8S-ITS2全长序列）、测序并与Genbank中已知真菌菌株相应序列比对。根据Gen-Bank序列同源性比较，菌株与Xylariales sp.(GenBank登录号JF288542.1)同源性为99％，初步判定该菌为炭角目属真菌。基于以上特征，将该植物内生菌株鉴定为Xylariales sp.。

之后研究团队采用炭角目菌植物内生菌Xylariales sp.转化三七总皂苷制备越南参皂苷R13-、三七皂苷J-、西洋参皂苷L16-。研究采用常规PDB培养基活化培养炭角目菌植物内生菌Xylariales sp.，将活化后菌种接种到无菌PDB培养基进行扩大培养，接种量为质量百分比0.2％，摇床培养5d；按三七总皂苷与乙醇溶液的质量比为1:4的比例，用体积百分比浓度为75％的乙醇溶液溶解三七总皂苷，浸泡三七总皂苷20min后，在无菌条件下倒入培养结束后的菌液中，底物三七总皂苷的添加量为菌液质量的0.05％，放置摇床继续培养12d；发酵结束后，采用超声法破碎菌丝团，超声10min，然后减压抽滤分离发酵液与菌丝体，浓缩发酵后抽滤液，发酵液萃取4次后减压蒸发浓缩，最终越南参皂苷R13-、三七皂苷J-、西洋参皂苷L16-含量为31.3％，18.5％，6.0％。

▲图1  a、b、c分别为越南参皂苷R13-、三七皂苷J-、西洋参皂苷L16-的化学式分

采用常规马丁氏培养基活化培养炭角目菌植物内生菌Xylariales sp.，将活化后的菌种接种到无菌PDB培养基进行扩大培养，接种量为质量百分比2％，摇床培养3d；按三七总皂苷与乙醇溶液的质量比为1：6的比例，用体积百分比浓度为70％的乙醇溶液溶解三七总皂苷，浸泡三七总皂苷10min后，倒入培养结束后的菌液中，底物三七总皂苷的添加量为菌液质量的0.5％，放置摇床继续培养8d；发酵结束后，采用超声法破碎菌丝团，超声20min，然后减压抽滤分离发酵液与菌丝体，浓缩发酵后抽滤液，发酵液萃取4次后减压蒸发浓缩，最终越南参皂苷R13-、三七皂苷J-、西洋参皂苷L16-含量为25.8％，16.3％，5.7％。

采用常规马丁氏培养基活化培养炭角目菌植物内生菌Xylariales sp.活化后菌种接种到无菌PDB培养基进行扩大培养，接种量为质量百分比9％，摇床培养2d；按三七总皂苷与乙醇溶液的质量比为1：10的比例，用体积百分比浓度为73％的乙醇溶液溶解三七总皂苷，浸泡三七总皂苷30min后，倒入培养结束后的菌液中，底物三七总皂苷的添加量为菌液质量的1％，然后放置摇床继续培养8d；发酵结束后，采用超声法破碎菌丝团，超声30min，然后减压抽滤分离发酵液与菌丝体，浓缩发酵后抽滤液，发酵液萃取4次后减压蒸发浓缩，最终越南参皂苷R13-、三七皂苷J-、西洋参皂苷L16-含量为25.7％，17.1％，5.3％。

采用常规PDB培养基活化培养炭角目菌植物内生菌Xylariales sp.将活化后菌种接种到无菌PDB培养基进行扩大培养，接种量为质量百分比0.1％，摇床培养8d；待菌丝体布满培养基时，12000r/min离心，取上清液用80％乙醇醇沉法分离出粗酶，然后10000r/min离心分离获得粗酶沉淀，按1g粗酶添加磷酸缓冲液1L的比例，用pH 6磷酸缓冲液涡旋震荡溶解粗酶沉淀，制得粗酶液；按三七总皂苷与乙醇溶液的质量比为1：4的比例，用体积百分比浓度为75％的乙醇溶液溶解三七总皂苷，浸泡三七总皂苷20min后，倒入粗酶液中，底物三七总皂苷的添加量为酶液质量的0.05％，然后轻轻震摇转化3d；最终越南参皂苷R13-、三七皂苷J-、西洋参皂苷L16-含量为28.7％，18.3％，6.1％。

采用常规马丁氏培养基活化培养炭角目菌植物内生菌Xylariales sp.活化后菌种接种到无菌PDB培养基进行扩大培养，接种量为质量百分比5％，摇床培养4d；待菌丝体布满培养基时，6000r/min离心，取上清液用80％乙醇醇沉法分离出粗酶，然后于12000r/min离心分离获得粗酶沉淀，按1g粗酶添加磷酸缓冲液0.8L的比例，用pH 7磷酸缓冲液涡旋震荡溶解粗酶沉淀，制得粗酶液；按三七总皂苷与乙醇溶液的质量比为1：8的比例，用体积百分比浓度为70％的乙醇溶液溶解三七总皂苷，浸泡三七总皂苷30min后，倒入粗酶液中，底物三七总皂苷的添加量为酶液质量的0.5％，然后轻轻震摇转化2d；最终越南参皂苷R13-、三七皂苷J-、西洋参皂苷L16-含量为24.6％，15.2％，4.9％。

发酵结束后经TLC检测发现发酵后总皂苷中无明显的原有人参皂苷物质，故推测三七总皂苷中原有人参皂苷均被羟基化，经9g三七总皂苷转化后即得富含越南参皂苷R13-、三七皂苷J-、西洋参皂苷L16-的转化后三七总皂苷，最终越南参皂苷R13-、三七皂苷J(Notoginsenoside J)、西洋参皂苷L16-含量为31.04％，19.73％，6.22％。分离纯化后获得2.79g越南参皂苷R13-、1.78g三七皂苷J-、0.56g西洋参皂苷L16-。

综上所述，该技术与一般的微生物发酵法相比，转化效率高，转化部位特异性高，使用该种炭角目菌植物内生菌，操作简单，转化特异性强，微生物次级代谢产物少，提取发酵产物简单；本发明为工业化生产越南参皂苷R13-、三七皂苷J-、西洋参皂苷L16-提供了一种简便方法，可通过三七总皂苷的生物转化制备获得大量的越南参皂苷R13-、三七皂苷J-、西洋参皂苷L16-。

* 技术内容来源：《一种炭角目菌植物内生菌及应用》，崔秀明、杨晓艳、郭从亮、陈子明、曲媛、杨野、刘迪秋、王承潇