酒精相关性肝病（Alcohol-related liver disease，ALD）主要是因长期过量摄入乙醇所致的肝脏疾病，包括单纯性脂肪变性、酒精性肝炎、肝硬化及肝细胞癌^[1]。该病缺乏特异性，实验室检测谷丙转氨酶（alanine amino transferase，ALT）和谷草转氨酶（aspartateamino transferase，AST）升高及平均红细胞体积增加。病理改变以大泡性脂肪变性为主，或伴小泡性混合型改变。临床干预以乙醇戒断及营养支持为主，必要时联合糖皮质激素及保肝药物，但现有方案存在药物性肝损伤风险及代谢相互作用等局限性^[2]。

双孢蘑菇的生物活性成分主要为多糖（Agaricus bisporus polysaccharide，ABP）、多酚及维生素等。现有研究表明，ABP具有显著抗氧化、免疫调节及肝保护效应^[3]。然而，ABP干预ALD的研究仍存空白。本研究构建了急性ALD小鼠模型，通过血清生化、肝脏病理及分子生物学多维度指标分析，系统阐明ABP保护肝脏作用及其与肠道屏障修复的关联机制，为开发ABP作为功能性食品成分提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  主要材料与试剂

双孢菇多糖，多糖含量为30%~50%；氯仿、福尔马林（分析纯）；ALT、AST、甘油三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白（Low density lipoprotein，LDL）、高密度脂蛋白（High density lipoprotein，HDL）；RNA逆转录试剂盒和qPCR试剂盒；BCA试剂盒；TLR4、NF-κB和IκB抗体，β-actin抗体。

1.2  主要仪器与设备

微量核酸检测仪、多功能酶标仪；Western Blot电泳仪、转膜仪；倒置荧光显微镜；qPCR系统。

1.3  实验动物

C57BL/6J雄性小鼠30只，体重18—22g，许可证号：SCXK（京）2019-0008。

1.4  实验方法

（1）小鼠分组及模型建立：SPF级小鼠适应性饲养7天，随机分为对照组（NC）、酒精性肝病组（ALD）及ABP干预组（n=10）。ABP组每日灌胃0.2mLABP（200mg/kg），其余组给予等体积PBS，持续30天。ALD与ABP组接受2次乙醇灌胃（50%乙醇，10mL/kg及5mL/kg，间隔1h），NC组灌胃等热量麦芽糖。造模16h后取材，血清及组织样本-80℃冻存。

（2）观察肝脏形态和记录结肠长度：分离小鼠肝脏，观察形态变化；分离结肠并测量结肠长度。

（3）转氨酶及血脂测定：分离小鼠血清并按照对应试剂盒说明书进行测定。

（4）病理学和免疫荧光检测：肝/结肠组织经4%福尔马林固定后进行常规脱水、石蜡包埋。肝切片H&E染色镜检；结肠切片经抗原修复、封闭后依次孵育ZO-1、Cy3二抗及DAPI，荧光显微镜观察并使用Image J软件定量分析阳性区域。

（5）qPCR检测：提取小鼠肝脏RNA，按反转录试剂盒说明将RNA反转录成cDNA，以β-actin为内参，在荧光定量分析仪上进行cDNA的荧光定量分析，引物序列见表1。

（6）Western Blot方法检测TLR4/NF-κB通路：提取肝脏总蛋白并测定蛋白浓度。配制10%的SDS-PAGE凝胶进行蛋白电泳。电泳完毕后进行湿式转膜，再经过封闭、一抗、二抗，最终显影观察，并用Image J软件进行定量分析。

1.5  统计学处理

采用GraphPad Prism 9.0软件对数据分析处理并绘图。数据用x-±SD表示。三组间均数比较采用单因素方差分析，P<0.05表示在统计学上呈显著差异。

2  结果与分析

2.1  ABP缓解急性ALD小鼠肝脏病理改变 

肝脏外观及HE染色如图1a-d所示，NC组肝脏呈暗红色、质地均匀，组织学显示完整肝小叶结构伴放射状肝细胞索排列；ALD组表现为肝大伴黄白色脂质沉积，镜下可见肝细胞气球样变、微/大泡混合型脂肪变性及小叶内淋巴细胞浸润；ABP干预组肝脏色泽与质地接近生理状态，HE染色肝细胞索结构组织部分恢复，气球样变、脂肪变性、炎细胞浸润明显改善。

2.2  ABP对急性ALD小鼠血清血脂和肝酶活性的影响

如图1e-f所示，与NC组相比，ALD组小鼠血清的TG、ALT、AST均极显著升高（P<0.05），而ABP干预后逆转此现象（P<0.001）。

2.3  ABP对急性ALD小鼠肝脏炎症因子的影响

肝脏促炎因子定量分析显示（图1g-h），ALD组TNF-α及IL-6 mRNA转录水平较NC组显著上调（P<0.0001），而ABP干预后两者表达量均降低（P<0.01）。

2.4  ABP对急性ALD小鼠肠屏障的保护作用

肠屏障完整性破坏可导致脂多糖（Lipopolysacc haride，LPS）等毒性物质易位，促进肝损伤进程。结肠形态学评估（图2a-b）显示，ALD组结肠长度较NC组显著缩短（P<0.001），而ABP干预可逆转此现象（P<0.01）。免疫荧光定量检测发现（图2c-d），ALD组ZO-1蛋白表达较NC组明显下调（P<0.0001），ABP干预使其表达量显著恢复（P<0.001）。

2.5  ABP对急性ALD小鼠TLR4/NF-κB炎症信号通路的影响

肝组织TLR4/NF-κB信号通路蛋白结果如图3所示，与NC组相比，ALD组小鼠肝脏中TLR4、NF-κB及p-IκB的表达量均显著升高，IκB表达量显著降低（P<0.001），而ABP干预后可逆转此现象（P<0.001）。

3  讨论

炎症作为ALD核心病理机制，通过诱导肝细胞坏死、纤维化及恶性转化驱动疾病进展^[4]。炎症级联反应在ALD从脂肪性肝炎向肝硬化、肝细胞癌转化过程中发挥关键作用，其激活机制涉及肝细胞程序性死亡、肠道屏障通透性异常及肠道菌群稳态失调^[5]。ABP作为具有多重生物活性的天然产物，可通过增强免疫调节功能、激活自然杀伤细胞活性、抑制结肠癌变及改善炎症性肠病模型病理特征展现出潜在临床价值。

本研究聚焦于ABP对ALD的预防效应，实验数据显示，ALD模型组肝脏表现为病理性肿大伴实质脆性增高及颗粒样物质沉积，而ABP干预组呈现肝体积正常化及组织质地改善。病理学评估显示，模型组肝组织存在典型气球样变性、广泛脂肪空泡形成及炎性细胞浸润，而ABP干预后上述病理特征显著缓解。血清学检测表明ABP可有效抑制ALD模型升高的ALT和AST水平。鉴于肝脏脂代谢由核受体网络、转录调控因子及信号通路精密调控，乙醇暴露通过破坏脂代谢稳态诱发肝细胞内脂质蓄积^[6]，而ABP干预显著降低TG水平，提示其具有调节脂代谢紊乱的作用。机制研究发现，乙醇诱导的氧化应激通过激活促炎细胞因子（TNF-α、IL-6）级联反应加剧肝损伤，而ABP干预组炎症因子表达显著下调。肠-肝轴分析显示ABP可逆转ALD模型结肠缩短及紧密连接蛋白ZO-1表达抑制，分子机制证实其通过靶向抑制TLR4/NF-κB信号通路磷酸化，降低Kupffer细胞活性及促炎介质释放。综上，ABP通过多靶点调控机制改善乙醇性肝脂肪变性、抑制炎症浸润、修复肠道屏障功能，其作用核心在于阻断TLR4/NF-κB通路介导的炎症信号传导，本研究为ABP作为功能性食品成分开发提供了分子药理学依据。

参考文献：

[1] 李志国,朱顺,李硕.《2019 年美国肝病学会临床指南:酒精相关性肝病的诊断和治疗》推荐意见[J].临床肝胆病杂志,2019,35(11):2447-2448.

[2] 中华医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组,中国医师协会脂肪性肝病专家委员会.酒精性肝病防治指南(2018更新版)[J].中华肝脏病杂志,2018,26(3):188-194.

[3]Liu G,Ye J,Li W,et al.Extraction,structural characteri zation,and immunobiological activity of ABP Ia polysaccharide from Agaricus bisporus[J].International Journal of Biological Macromolecules,2020,162:975-984.

[4]Luo P,Zheng M,Zhang R,et al.S-Allylmercaptocysteine improves alcoholic liver disease partly through a direct modulation of insulin receptor signaling[J].Acta Pharmaceutica Sinica B,2021,11(3):668-679.

[5]Wu X,Fan X,Miyata T,et al.Recent advances in understan ding of pathogenesis of alcohol-associated liver disease[J]. Annual Review of Pathology,2023,18:411-438.

[6]You M,Arteel G E.Effect of ethanol on lipid metabolism[J].Journal of Hepatology,2019,70(2):237-248.

原文来源:冯婉君.双孢菇多糖对急性酒精相关性肝病保护作用的研究[J].营养保健,2025:76-78.