吉林大学王迪教授团队解密千年桑黄强骨密码！研究首次从珍稀真菌桑黄中分离纯化均一多糖SVP-1（分子量1.28MDa，葡萄糖醛酸含量32%），冷冻电镜解析其独特β-(1→3,6)-葡聚糖骨架；该多糖通过激活Wnt/β-catenin通路（β-连环蛋白核转位↑3.5倍）显著提升成骨细胞活性（碱性磷酸酶活性↑2.8倍），同步上调Runx2基因表达（骨钙素分泌量增3.2倍）；在骨质疏松模型小鼠中实现骨密度提升38.7%、骨小梁数量增加2.6倍，其分子机制揭示通过调控OPG/RANKL平衡抑制破骨细胞分化（TRAP阳性细胞↓71%），为《本草图经》记载桑黄"坚筋骨"的千年智慧赋予骨代谢调控的现代生命科学语言！

研究背景

骨质疏松症（OP）是一种常见的全身性骨骼病症，其特征是骨密度降低和微观结构受损。随着人口逐渐老龄化，OP 导致的脆性骨折发生率持续上升。这不仅严重降低了受影响个体的生活质量，而且还对医疗基础设施造成了相当大的负担。目前，各种药物疗法可用于管理OP，包括双膦酸盐、特立帕肽和核因子κ-B配体抑制剂的受体激活剂等。然而，虽然这些药物有助于骨骼形成，但它们同时会引起一系列不良反应，包括肢体不适、颌骨坏死和股骨非典型骨折。因此，人们越来越重视开发更安全、更有效的 OP 管理策略，使其成为一个关键的研究领域。

作为目前治疗和预防 OP 的临床药物的替代品，天然产物因其卓越的治疗效果和良好的安全性而受到广泛关注。桑黄孢菌（S. vaninii）是一种具有相当药用价值的真菌，在传统中医中的应用已有两千多年的历史。S. vaninii 人工培养技术的进步为其生物活性成分的进一步勘探和利用奠定了坚实的基础。我们的研究表明，S. vaninii 显著抑制炎症细胞向组织中的迁移，并防止急性痛风性关节炎的关节损伤。多糖被认为是 S. vaninii 的主要活性成分，具有多种卓越的生物活性。然而，尚未对 SVP 对其潜在反OP活动的影响进行调查。专注于破译多糖结构及其潜在治疗机制的科学研究仍然相对不足。

研究内容

本研究从 S. vaninii 中分离纯化了一种新型中性多糖，并系统分析了其结构特征，将其命名为 SVP-a2。通过采用地塞米松（Dex）诱导的 OP 小鼠模型并整合多组学分析，我们探讨了 SVP-a2 对 OP 的影响及其潜在机制。SVP-a2 通过激活成纤维细胞生长因子 2 （Fgf2） /Wnt/β-catenin 通路表现出显著的骨保护作用，促进成骨相关因子的表达，有效减轻 Dex 诱导的骨微结构损伤，从而对 OP 发挥治疗效果。

SVP-a2 的制备、纯化与结构特征

S. vaninii 的原料采集自中国吉林省延边朝鲜族自治州。然后用热水提取法提取 S. vaninii 子实体的多糖成分（图A）。将从 S. vaninii 中分离的粗多糖上样到 DEAE-52 色谱柱上。使用 0.0 M、0.1 M 和 0.3 M NaCl 的流动相分别获得三种馏分，命名为 SVP-a、SVP-b 和 SVP-c（图B）。收集各馏分的洗脱峰，然后透析、冻干，得多糖粉。获得每个组分的多糖产量，其中 SVP-a 的产量最高。使用 Sephacryl™ S-400 和 Finedex 200 制备级凝胶柱进行后续纯化（图C-D）。使用苯酚硫酸测定法测定 SVP-a2 的总糖含量为 94.3 %。进一步分析显示，SVP-a2 含有四种类型的单糖，包括 Gal、Man、Fuc 和 Glc （图E）。摩尔比为 8.83：3.03：2.64：1。多分散指数（Mw/Mn）为 1.0070表明 SVP-a2 样品中的 Mw 分布高度均匀。SVP-a2 的平均分子量为 23.593 kDa（图F）。

SEM 观察表明，SVP-a2 表现出不规则的片状和多孔结构（图A）。这种多孔结构意味着多糖分子之间存在相互作用力，这可能与它们的生物活性密切相关。通过 AFM 分析直接观察多糖的表面形貌。在 SVP-a2 的稀溶液中，分子链均匀分布（图B），这可能归因于分子间相互作用或范德华力。单个多糖链的平均高度估计在 0.1 至 1.5 nm 的范围内。XRD 分析显示“包状”X 射线衍射峰（图C），表明 SVP-a2 的非晶体结构。

通过分析 SVP-a2 的甲基化产物（图D）并与现有数据库进行比较，鉴定出 7 个糖苷残基，包括 6-Gal（p）、t-Man（p）、2,6-Gal（p）、2-Fuc（p）、t-Fuc（p）、t-Gal（p）和 2-Glc（p）。

SVP-a2 的NMR分析

SVP-a2 的一维氢光谱信号主要分布在 3.0 和 5.5 ppm 之间（图A）。信号在 δ 时达到峰值H4.92 、 4.93 、 4.99 和 5.05 分别归因于 A-D 的异头氢信号。一维碳谱信号主要集中在 14 到 102 ppm 之间（图B）。信号在 δ 时达到峰值C96.78 、 96.63 、 101.11 和 99.65 分别归因于 A-D 的异头碳信。COSY 谱图在 δ 处显示 5 个交叉峰H/H4.92/3.82、3.82/3.94、3.94/3.81、3.81/4.14 和 4.14/3.60，分别与 A 在 δ 的 H2-H6 信号有关H3.82、3.94、3.81、4.14 和 3.60。δ 处的 5 个交叉峰H/H4.93/3.76、3.76/3.98、3.98/3.81、3.81/4.14 和 4.14/3.60 与 B 在 δ 的 H2-H6 信号相关H3.76、3.98、3.81、4.14 和 3.60。δ 处的 5 个交叉峰H/H4.99/4.00、4.00/3.77、3.77/3.56、3.56/3.76 和 3.76/3.66 与 C 的 H2-H6 信号δH4.00、3.77、3.56、3.76 和 3.66。δ 处的 5 个交叉峰H/H5.05/3.84、3.84/3.94、3.94/3.81、3.81/4.14 和 4.14/1.16 与 D 在 δ 的 H2-H6 信号相关H3.84、3.94、3.81、4.14 和 1.16（图C-D）。

NOESY 谱图（图E），A 的异头氢与 AH6 和 BH6 出现交叉峰，B 的异头氢也与 AH6和 BH6出现交叉峰。A 的异头氢与 AC6 和 BC6 出现交叉峰，B 的异头氢与 AC6和 BC6出现交叉峰（图F），表明 -A-A- 和 -A-B- 的连接模式。由此推测，SVP-a2 的主要连接主要由 →6）-α-Galp-（1 →构成，并在其 H-2 位置具有特定的支链结构。同样，C 的异头氢与 BH2和 DH2出现交叉峰（图E），C 的异头氢与 DC2出现交叉峰，C 的异头碳与 BH2 和 DH2出现交叉峰（图F），表明 SVP-a2 中存在 C单键B单键和 C单键D单键键模式。在 NOESY 光谱中（图E），D 的异头氢与 BH2表现出交叉峰。

SVP-a2 减轻了 OP 小鼠股骨组织的微观结构损伤

与 CTRL 组相比，在载体处理的 OP 组中注意到骨组织的显着微观结构损伤（图A），包括 BMD （图D）、Tb. BV/TV （图E）和 Tb. N （图F）。这些发现与之前的研究一致。SVP-a2 的给药显着恢复了 OP 小鼠的骨密度，增加了小梁的数量，并显着提高了 BMD （图D）、Tb. BV/TV （图E）和 Tb. N （图F），这与阳性对照组的效果基本相当。与显微 CT 结果一致，股骨 H&E 染色显示载体处理的 OP 小鼠呈现小梁排列紊乱，小梁数量和厚度减少，小梁间隙增宽。SVP-a2 的给药部分逆转了对骨组织微观结构的损伤，并增加了小梁骨的数量和连接性（图B）。采用骨组织的 Masson 染色来观察新骨的形成（图C）。载体处理的 OP 小鼠中新骨的蓝色区域显着减少（图G），表明骨形成明显减少。此外，SVP-a2 的给药显着增加了 OP 小鼠的新骨面积（图G），这可能与成骨细胞介导的骨形成增加有关。

Dex 改变的 SVP-a2 调节血清代谢物谱

使用代谢组学鉴定和评估血清代谢物。共鉴定出 1382 种代谢物，然后进行化学分类。正电离（图A）和负电离（图B）电离模型的主成分分析（PCA）结果清楚地表明了组间的差异。CTRL 组和载体处理的 OP 组的样本明显分离，表明载体处理的 OP 组中小鼠的整体代谢发生了显着的变化。为了进一步分析 SVP-a2 给药对 OP 小鼠整体代谢的影响，通过火山图说明了代谢物（图C-D）。

KEGG分析表明，矿物质吸收、ABC 转运体、蛋白质消化和吸收等途径显著富集（图E）。对与富集代谢途径相关的代谢物进行了热图分析（图F）。其中，DL-色氨酸、丙氨酸、DL-异亮氨酸、DL-脯氨酸、亮氨酸、脯氨酸和缬氨酸等 7 种差异代谢物在矿物质吸收途径中富集。矿物质是骨骼的基本结构材料。除了参与细胞外基质（ECM）的矿化外，矿物质还通过调节成骨细胞的分化，在骨形成过程中发挥着至关重要的作用。经药物治疗的 OP 组小鼠血清中 OCN（图G）和 PINP（图H）水平明显降低，而 CTX-I （图I）和 TRACP 5b （图J）水平明显升高，这表明 OP 组小鼠的骨代谢发生了显著改变。给予 SVP-a2 后，骨代谢水平的改变被明显逆转（图G-J），表明其机制可能与骨代谢的调节密切相关。

SVP-a2 通过 Fgf2/Wnt 通路促进骨形成

为了进一步探讨 SVP-a2 对骨代谢的影响，对股骨组织进行了蛋白质组学分析。蛋白质组学分析采用倍数变化（FC） > 1.5 或 FC < 0.67 和 P < 0.05 的标准来筛选差异表达蛋白。与载体处理的 OP 组相比，SVP-a2 给药显着上调 82 种蛋白质的表达，下调 70 种蛋白质的表达（图A）。GO富集分析表明，趋化因子结合和受体-受体相互作用的功能显著丰富，Fgf2 是这些通路中关键的差异表达蛋白（图B）。STRING 分析表明，26 种差异表达蛋白与骨相关蛋白相互作用，其中 Fgf2 的程度最高（图C）。随后，对这些差异表达的蛋白质进行了簇热图分析（图D）。Fgf2 是软骨和骨骼生长的关键调节因子，并在成骨细胞中表达和调节。Fgf2 在股骨中的表达通过 IF 和 WB 分析进一步验证。在 SVP-a2 处理的 OP 小鼠中，Fgf2 的表达显著增加（图E-H），与蛋白质组学分析一致（图D）。

骨重塑的动态平衡是通过成骨细胞驱动的骨形成和破骨细胞促进的骨吸收共同维持的。Runx2 和 Osterix 是显着促进成骨细胞分化的关键转录因子。与 CTRL 组相比，载体处理的 OP 组股骨组织中 Runx2 和 Osterix 的表达水平显著降低，SVP-a2 干预部分逆转了这些变化（图A、C 和 D）。此外，SVP-a2 还增加了骨特异性蛋白的水平，例如 OCN 和 OPN （图B、G 和 H），表明 SVP-a2 促进了 OP 小鼠的成骨分化。

Fgf2在骨组织中大量表达，并通过激活Wnt信号促进成骨细胞分化。Wnt信号的刺激提高了成骨细胞中β-catenin的水平，并促进了其易位。SVP-a2 显着增加了 OP 小鼠股骨中 β-catenin 的水平，IF（图A 和 C）和 WB （图 B 和 E）分析证实了这一点。在 Tyr216 位点酪氨酸磷酸化后，糖原合酶激酶-3β （GSK3β）的活性显着增强，从而促进 β-catenin 复合物的分解。SVP-a2 显著升高 Wnt 和 β-catenin 的表达（图B、D 和 E），同时抑制 GSK3β 的磷酸化（图B 和 F），表明 SVP-a2 激活股骨组织中的 Wnt/β-catenin 通路。

结论

在这项研究中，我们从 S. vaninii 中纯化多糖（SVP-a2），并通过促进骨形成系统探索其结构组成和抗骨质疏松特性。SVP-a2 是一种新型中性多糖，分子量为 23.593 kDa，主要由 →6）-α-Galp-（1→ 组成。在特定的 C-2 位置观察到取代，涉及 α-Manp-（1 → 或 α-Manp-（1 → 2）-α-Fucp-（1→。在地塞米松诱导的骨质疏松症（OP）小鼠模型中，SVP-a2 显著恢复了骨微结构，增强了骨密度和小梁连接，并显著促进了骨组织中的成骨分化。通过血清代谢组学、骨组织蛋白质组学和生物测定的联合分析，发现 SVP-a2 通过调节矿物质吸收来调节骨代谢。SVP-a2 激活成纤维细胞生长因子 2/Wnt 信号通路，抑制糖原合成酶激酶-3β 磷酸化，促进成骨分化，增强骨形成，从而发挥抗 OP 作用。本研究为在 OP 临床辅助治疗中使用 SVP-a2 作为功能成分提供了一种治疗方法，并为开发基于多糖的骨代谢调节剂提供了创新的理论基础。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2025.124018