纤维素是植物细胞壁的主要成分，也是全球最丰富的可再生碳水化合物。由于其独特的物理和化学结构，被认为是“锁起来的能量库”，“难啃的硬骨头”。食用菌生产可将农作物秸秆、畜禽粪便和园林废弃枝条等转化为优质蛋白与健康食品，直接“变草为宝、点粪成金”。灵芝作为基因组中水解酶数量最多的食用菌之一，通过产生大量的纤维素酶来降解纤维素。最新研究证实，灵芝纤维素酶可把玉米秸秆、玉米芯等农业废弃纤维素转化为食用菌蛋白质。这相当于把“柴火”变成“瘦肉”，但灵芝如何利用纤维素的作用机制仍不清晰。

近日，南京农业大学赵明文教授团队在微生物权威期刊mBio杂志上发表题为“GlSlt2 positively regulates GlMyb-mediated cellulose utilization in Ganoderma lucidum”的文章。该研究揭示了灵芝丝裂原活化蛋白激酶GlSlt2通过磷酸化修饰转录因子GlMyb促进灵芝纤维素利用的作用机制。

具体结果：

一、GlSlt2提高灵芝纤维素酶活性。为了研究丝裂原活化蛋白激酶GlSlt2在灵芝纤维素利用中的作用，我们检测了GlSlt2沉默菌株和GlSlt2过表达菌株中的纤维素酶活性。结果显示Slt2沉默菌株显著低于野生型的内切纤维素酶活性（约降低55%）和外切葡聚糖酶活性（约降低58%）（图1A和B）。Slt2过表达菌株中的内切纤维素酶和外切葡聚糖酶活性分别提高了2.5倍和5倍（图1D和E），但沉默和过表达菌株中β-葡萄糖苷酶活性没有显著差异（图1C和1F）。说明GlSlt2提高灵芝内切和外切纤维素酶活性。

图1

二、GlSlt2磷酸化修饰转录因子GlMyb。为了探究GlSlt2调控纤维素利用的分子机制，通过酵母双杂交（Y2H）文库筛选发现GlSlt2与R2R3型GlMyb转录因子结合。并通过Y2H实验、双分子荧光互补（BiFC）实验和免疫沉淀实验进行验证（图2）。GlSlt2作为蛋白激酶，能够磷酸化修饰相互作用的蛋白。通过体内、体外磷酸化实验验证了GlSlt2对GlMyb的磷酸化，并找到了245位丝氨酸是磷酸化修饰的位点（图3）。

图2

图3

三、磷酸化的GlMyb提高纤维素酶基因表达并激活纤维素酶活性。为了研究GlMyb调控纤维素酶活性的分子机制，通过酵母单杂交实验、EMSA和染色质免疫沉淀实验（ChIP-qPCR）验证了GlMyb可以与纤维素酶相关基因的启动子结合情况。发现第245位丝氨酸的磷酸化增强GlMyb与纤维素酶基因（CBH1、CBH3、EG1、EG3和EG5）启动子的结合能力（图4）。进一步采用了RNAi技术筛选了GlSlt2-GlMyb的双沉默菌株（Slt2i-Mybi-2和Slt2i-Mybi-3），并测定了内切纤维素酶和外切葡聚糖酶的活性。酶学测定表明，与GlSlt2单沉默菌株相比，GlSlt2-GlMyb双沉默菌株的内切纤维素酶和外切葡聚糖酶活性显著降低，其水平与GlMyb单沉默菌株中观察到的酶活相似（图5）。说明磷酸化的GlMyb提高纤维素酶基因表达并激活纤维素酶活性。

图4

图5

结论：在本项研究中探究了丝裂原活化蛋白激酶GlSlt2调控灵芝利用纤维素的作用机制，通过酵母双杂交筛库、双分子荧光互补实验和免疫沉淀实验发现，GlSlt2能够与R2R3型Myb转录因子相互作用，并且GlSlt2磷酸化修饰GlMyb的第245位丝氨酸。进一步通过酵母单杂交实验、EMSA和ChIP-qPCR证明GlMyb的245位丝氨酸磷酸化促进其与多个纤维素酶相关基因启动子的结合（纤维二糖水解酶CBH1和CBH3、内切葡聚糖酶EG1、EG3和EG5），并促进纤维素酶基因表达。本研究揭示了灵芝纤维素利用的作用机制，这些结果为生物质转化和生物圈碳循环奠定了基础。