序

荷兰的Mirjam A. Kabel团队解答了一个大家一直忽略的重要问题“蘑菇栽培原材料中的木质素在蘑菇生长发育中究竟扮演了什么角色”。木质素是否只是蘑菇在利用纤维素和半纤维素过程中的障碍？蘑菇降解木质素后是否会利用其降解产物作为碳源生长，这些问题一直没有得到关注。本研究中Mirjam A. Kabel团队利用碳13标记的底物研究了双孢菇对木质素的降解（解聚）和利用过程，并首次通过严谨的实验证明了双孢菇可以利用木质素作为碳源进行生长。之后其他团队在此基础上进行了木质素降解产物降解分子机理的解析，本公众号将会在后续文章中对该部分工作进行介绍。

发表期刊：Science Advances

通讯作者：Mirjam A. Kabel

DOI号：10.1126/sciadv.adl3419

摘要

通常研究者认为碳水化合物是真菌代谢的主要营养来源，而真菌对木质素只是单纯的降解和矿化为二氧化碳。最近的研究表明真菌能够将碳13标记的芳香化合物转化为蛋白质氨基酸。为了验证木质素多聚物是否可以作为营养参与真菌代谢生长，本研究分离了碳13标记的天然木质素作为唯一碳源培养双孢菇菌丝。结果表明，双孢菇能够通过分泌木质素降解酶对木质素进行解聚和降解，计算的木质素碳利用效率为0.14（g/g）。碳13分析表明碳13能够在菌丝体生物质中富集，其中氨基酸富集的碳13水平最高。表明双孢菇能够同化木质素并且进一步将木质素降解产物作为碳源参与细胞代谢。推测木质素的利用是通过芳香族化合物环裂解中间体进入核心代谢途径。本研究证明了木质素对真菌具有潜在的营养价值。

木质素支持真菌生长 

从木质素到真菌生物质 

利用碳13标记的天然小麦木质素作为唯一碳源，在液体基本培养基中培养双孢菇菌丝15天（图1B，13CLG+Ab）。虽然木质素经过了多步的纯化，其纯度已经达到了93%，不过还是有少量的多糖和脂类杂质残留，主要是阿拉伯糖、木糖，还有少量的葡萄糖、脂类等。因此，对照组在加入与实验组相同的未标记的木质素基础上，又加入了与碳13-木质素中残留杂质浓度相同的碳13-标记的阿拉伯糖、木糖、葡萄糖和脂质（图1B，12C*LG+Ab）。

图1 评估双孢菇是否能够对碳13同位素标记的木质素进行结构修饰、解聚、同化及代谢的整体研究方案描述

所有组中的双孢菇菌丝都能够正常生长，菌丝与木质素紧密交织在一起形成致密的菌丝网络（图2E）。为了计算木质素绝对质量的去除率，测定了培养后样品中的可溶性木质素、不溶性木质素以及真菌生物质。13CLG+Ab和12CLG+Ab两个组中的木质素去除率分别为18.1%和17.6%。为了进一步确认是否木质素的减少与真菌生长相关，研究计算了碳利用效率（CUEs）。13CLG+Ab和12CLG+Ab两个组的CUEs分别为0.14和0.16（图2B）。这是首次报道了真菌的木质素碳利用效率。

实验中使用的木质素中还有一些多糖等碳源的残留，这些底物也会促进真菌生长，可能会使得木质素利用CUEs被高估。假设所有的残余的碳源被充分利用，且所有的碳源的CUE跟葡萄糖一致都为0.5，那么形成的真菌生物质（图2C 黑色）也要小于实验测定的真菌生物质（图2C）。真实测定的生物质比杂质理论能够生成的生物质高了139%~367%。实际上很多杂质的CUEs并没有0.5，比如阿拉伯糖和木糖混合物的CUE就比0.5低，而且反应结束后碳水化合物并没有被完全利用。因此实验结果可以证明木质素是真菌生长发育过程中使用的主要碳源。

 图2 双孢蘑菇能够代谢木质素以促进真菌生物量的形成

双孢菇改变了木质素结构

伴随着木质素的去除和菌丝的生长，剩余木质素的结构发生了剧烈改变，表明了木质素在胞外发生了裂解和氧化反应。利用热裂解气相色谱质谱联(Pyrolysis-GC-MS)和异核单量子相干核磁共振（HSQC NMR）分析都可以证明在可溶性木质素中检测到了转化产物的积累（图3）。两种方法都显示在在完整的亚结构单元连接键减少的情况下，出现了Cα-氧化亚结构和特征性裂解产物的累积。

利用HSQC NMR检测到的木质素结构的变化（图3），与之前的研究中，在工业生产环境下双孢菇对底物中木质素降解的表征结果一致。这种一致性表现在对于某些亚基降解的偏好性（图3E），以及类似的木质素特征裂解产物业的积累。这表明，在实验室环境中双孢菇对木质素的降解策略与大规模生产时对底物中木质素的降解策略类似。然而，不溶性木质素并没有受到菌丝的降解的影响，与可溶性木质素部分相比较，结构改变更少。

 图3 真菌处理后的可溶性木质素组分的HSQC NMR分析

双孢菇分泌木质素降解酶系

真菌会分泌大量胞外酶降解木质素，其中大多数是氧化还原酶。本研究在双孢菇降解木质素（12CLg + Ab）的样本中鉴定到了500个分泌蛋白，其中72个是CAZymes。鉴定到了27个酶受到了木质素和芳香族化合物的诱导（图4）。有23个属于AA家族的，其中AA1_1家族有8个，AA3_2家族有8个，5个AA5_1家族，1个AA1_2家族和一个AA2家族蛋白（图4）。在高丰度的漆酶中，有一个漆酶（ID 139148；图 4）在双孢菇工厂化生产的分泌组中丰度也很高，进一步说明了实验室规模的反应过程中双孢菇的木质素降解策略与工厂化生产过程中的类似。

 图4 木质素培养下双孢菇的分泌蛋白质组分析

真菌生物质中碳13富集分析

追踪蘑菇生物质中的碳13同位素，可以为双孢菇利用，木质素提供坚实的实验证据。本研究检测了一些标志性分子中的碳13富集水平，包括蛋白质（氨基酸）、细胞壁β-葡聚糖（己糖）、RNA和DNA（核糖）、脂类（脂肪酸）以及麦角固醇（图 5）。此外本研究还利用碳13标记的葡萄糖、非同位素标记葡萄糖、非同位素标记木质素培养了双孢菇菌丝，用于评估碳13同位素成分的富集情况。利用非同位素标记的木质素培养的实验结果证明了木质素降解产物并不会干扰碳13富集的分析。

根预期一样，在碳13-标记木质素中培养的双孢菇菌丝生物质中，所有成分均出现了碳13富集现象，不同的组分碳13的富集水平存在差异（图5）。在13CLG+Ab组的生物质中，核糖、葡萄糖和葡萄糖胺的碳13富集水平是最低的（3.25%-12.52%），核糖是DNA和RNA的组成成分，葡萄糖和葡萄糖胺是细胞壁中葡聚糖和几丁质的主要成分。12C*Lg + Ab处理组的生物质中，核糖和葡萄糖的碳13富集水平跟13CLG+Ab组类似，都比较低。这表明了在真菌生长代谢过程中DNA/RNA和葡聚糖的中的核糖和葡萄糖更倾向于来自碳水化合物和脂类而不是由木质素转化产物合成而来。对于葡糖胺而言，来自12C*LG + Ab组的真菌生物量中的碳13富集水平甚至比来自13CLG + Ab组的更高，这表明了木质素降解产物转化成为几丁质组分的可能性更低。尽管如此，根据杂质的利用程度进行推算，来自于木质素的碳13仍然会一定程度的进入核糖、葡萄糖和葡萄糖胺中。

 两组碳13标记组中，大部分脂肪酸的碳13富集水平都比较低（1.0-17.7%）。但是长链脂肪酸behenic acid（C22:0）中，13CLg + Ab组的碳13富集水平达到了31.5%，而12C*Lg + Ab组只有2.0%。很明显双孢菇菌丝通过转化木质素合成了更多的C22:0脂肪酸。而另一种常常用于真菌菌丝生物量测定的脂类麦角甾醇中的碳13富集水平低于大部分脂肪酸，在13CLg + Ab和12C*Lg + Ab组中分别只有1.5%和1.4%（图5）。在13CLg + Ab组中蛋白质氨基酸的碳13富集水平达到了10.5%·26.3%，而且全部高于12C*Lg + Ab组的氨基酸碳13富集水平。这一结果证明了双孢菇在蛋白质合成过程中利用了木质素芳香族降解产物。在所有的氨基酸中富集水平最高的依次是Alanine（A，26.3%）、Leucine（L，25.2%）、valine（V，24.1%）、glycine（G，26.3%）、isoleucine（I，22.4%）、phenylalanine（F，20.7%）和proline（P，19.6%）（图5B）。

图5 真菌生物质化合物的碳13同位素标记分析

整体来说，木质素降解后的产物主要用于氨基酸的合成，也可能被用于其他的碳13富集水平较低的细胞组分的合成（如脂类、RNA、葡聚糖、几丁质等）。

讨论

本研究中首次证明了真菌能够利用木质素多聚物作为碳源进行生长，而不是仅仅在胞外将木质素转化为二氧化碳。目前真菌胞内芳香族化合物的降解分子机理还不清楚，有研究表明这些化合物可能会进入细胞内转化为碳代谢核心化合物乙酰辅酶A和琥珀酰辅酶A。也有研究表明芳香族化合物可能会经过环裂解反应转化为丙酮酸和富马酸。比如4-羟基苯甲酸会在裂解前转化为龙胆酸盐。碳13富集分析结果表明，A、I、V三种氨基酸的碳13富集水平最高，丙酮酸是这些化合物的直接前提，这也说明了丙酮酸可能是一个核心中间代谢产物。本文提出来了木质素的可能的代谢通路（图6）。

图6 真菌细胞利用木质素的代谢途径

目前围绕木质素的绿色高值转化主要是利用单细胞微生物开展的，将木质素降解后的单体芳香族化合物，转化为中心代谢产物用于化合物合成。多细胞的真菌或者微生物菌群可以直接转化木质素高聚物，本研究进一步证明了木质素转化后可以生成核心代谢产物用于真菌生长。本研究的结果对于研究陆地碳循环和碳固定具有重要意义。