2025年5月上海市农业科学院食用菌遗传团队在国际著名学术期刊International Journal of Biological Macromolecules（二区，IF= 8.5）发表关于菌丝体替代蛋白消化吸收方面的原创研究论文“Editing a mushroom with high-digestibility using a novel endo-N-acetyl-β-D-glucosaminidase”。

 

 

在这项研究中，表征了新型的内切-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷酶endo-CM在蘑菇形成真菌蛹虫草（Cordyceps militaris，CM）过程中发挥了维持真菌细胞壁的完整性方面的作用，具体表征做法为通过基因编辑，对Endo-CM启动子进行工程改造，以去除CmCreA碳分解代谢阻遏物的结合位点，并将转化体命名为CmT。用模拟消化液处理12小时后，CmT的残留菌丝生物量显著低于亲本菌株。同时，CmT在模拟消化过程中也释放了更多的氨基酸，这表明Endo-CM的表达水平会影响菌丝体生物量对消化酶的可及性。虽然CmT产生的子实体风味得到改善，但子实体产量下降。这项研究强调了生产具有高消化率的替代蛋白质，解决了菌物蛋白和食用菌在消化吸收率上的难题，为未来精准设计具有易吸收、易消化的食用菌新品种提供了可行方案。

 

先前的研究已经证实，由于真菌蛋白的碳水化合物不易消化，其消化率低于其他新型蛋白质。这个问题不仅影响食用菌菌丝体衍生的蛋白质^[1]，还影响其子实体来源的蛋白质，甲壳素微纤维是分枝杆菌蛋白纤维的主要成分，被认为是通过氢键形成的单个链和纤维生物合成的^[2]。这些微纤维与β-1,3-葡聚糖共价连接，后者通过分支网络与细胞壁表面的甘露糖蛋白连接^[3,4]。具有内切-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷酶（ENGase）型活性的酶（EC.3.2.1.96），是糖苷水解酶（GH）家族18、73和85^[5]相关蛋白，其主要参与糖苷连接寡糖生物过程。GH18家族的ENGase与III类几丁质酶具有序列相似性，而GH85家族的ENGases与其他ENGases具有三级结构同源性^[6]。这些酶可能是从N-糖基甘露糖蛋白水解真菌细胞壁寡糖保护最外层的有价值的工具，可能更容易获得蘑菇真菌蛋白和子实体中用于营养目的的氨基酸和肽^[7,8]。

 

真菌蛋白质的Ng糖基化位点上存在单个N-乙酰葡糖胺残基，这被归因于真菌体内或细胞外的ENGase型活性^[7,8]。增强的ENGase活性是否有助于真菌菌丝蛋白的消化尚不清楚。在这项研究中，CRISPR/Cas9系统被用于改造蛹虫草中一种推定的ENGase的启动子。工程化的蛹虫草对真菌蛋白和子实体的消化率有所提高。本研究首次证明了ENGase在蘑菇真菌蛋白中的应用，并展示了一种精确育种的范式，以开发具有增强消化率的蘑菇种质。

 

1 rEndo-CM对甘露糖蛋白表现出ENGase型活性

甘露糖蛋白和α-1,3-葡聚糖在真菌中形成极易移动的外壳。具有甘露糖蛋白ENGase型活性的天然酶有助于降解最外层的真菌细胞壁，但尚未在C.militaria中进行测试。为了分析ENGase的进化关系，本研究构建了一个发育树。结果表明，细菌ENGases Em Endo F和Sp Endo S与Endo-CoM显示出更高的同源性（图1A）^[9]；而GH18几丁质酶样酶（重新命名为Endo-CM）与Endo-T和Endo-FV显示出更高的同源性。Endo-CM被预测为一种分泌蛋白，里面有19个残基负责对底物的结合和水解活性，而催化四分体由四个残基组成（图1B），说明了Endo-CM是一种真正的ENGase，而不是基因组注释的凝血因子5/8型结构域蛋白或几丁质酶^[10]。

 

为了测试Endo-CM的ENGase型活性，我们选择了重组BglS（rBglS），它具有高甘露糖结构，可以被里氏木霉的内源性Endo-T水解，并以rBglS的去糖基化突变体rT4Q用作对照。重组Endo-CM和Endo-T在大肠杆菌BL21中异源表达，产生重组rEndo-CM和rEndo-T。根据蛋白质印迹分析，rBglS在25℃下处理过夜时表现出明显较低的分子量◦C与rEndo CM和rEndo T（图1C），这表明rEndo-CM和rEndo-T都能产生去糖基化的rBglS。除此以外，实验还证明了rEndo CM的水解酶活性在pH 5.0（图1D）和50°C（图1E）培养条件下具有最优的水解酶活性。

 

图1 Endo-CM的系统发育、结构和活性分析

 

2 Endo-CM基因在发酵后期的表达

为了确定Endo-CM是否在菌丝体生物量减少中起调节作用，利用发酵特性检测了C.militaria发酵过程中生物量、粘度和其他指标的变化，以及Endo-CM和Endo-CoM基因的表达趋势（图2）。蛹虫草CmU菌株的菌丝生物量（图2A）和肉汤粘度（图2B）在早期（0-7天）逐渐增加，并在第7天达到最大值；pH曲线与前两条曲线完全相反，在第7天降至最低点，在发酵的最后一天升至高于初始pH值（图2C）。这些结果表明，C.militaria的菌丝活力下降，细胞在第八天开始自溶。在早期阶段，由于代谢旺盛，会产生有机酸，导致pH值降低。在后期，由于细胞内容物的释放，pH值上调。

根据肉汤中残糖的检测，碳源在发酵的第五天就耗尽了（图2D）。这标志着Endo-CM表达上调的起点（图2E）；而Endo-CoM的相对表达在发酵过程中没有显著波动（图2F），这表明，Endo-CoM可能参与了昆虫中C.militaria感染的过程，而不是降解其自身的真菌细胞壁。

 

图2 蛹虫草摇瓶发酵特性分析

 

3 Endo-CM启动子的修饰解除葡萄糖引起的CCR抑制

葡萄糖通过转录因子CreA/CRE-1/Mig1^[11]的作用调节分泌酶的产生。因此，通过分析启动子区域中保守结合基序的存在，可以确认Endo-CM是否受CmCreA调节。因此，研究了Endo-CM是否参与了碳饥饿期间菌丝细胞壁的降解（由CmCreA调节）。

 

对Endo-CM启动子序列的分析揭示了四个推定的CmCreA结合位点，分别位于C1（-728至-723）、C2（-508至-503）、C3（-136至-131）和C4（-125至-120）（图3A和S1），并设计了三种sgRNA靶向四种潜在的保守结合基序。由于C3和C4非常接近，sgRNA3被用来同时靶向这两个位点（图3A和S1）。经过四天的培养，与亲本菌株CmU相比，所有sgRNA1转化体的Endo-CM表达均显著增加。然而，几乎所有的sgRNA2和sgRNA3转化体与CmU没有显著差异，或者无法检测到Endo-CM的转录（图3B）。这些结果表明，工程化启动子的C1转录调控区比工程化C2、C3或C4产生更积极的效果。这些位点的改变可能导致启动子失活。

 

进一步分析了显示Endo-CM表达最高上调的sgRNA1转化体（命名为CmT）。测序结果显示，CmT的Endo-CM启动子中有一个16 bp的缺失，这破坏了CmCreA位点C1（图3B和S1）。扫描电镜和透射电镜显示，亲本菌株CmU的菌丝直径较大（~5μm）（图3C），细胞壁更完整光滑（图3D）。相比之下，CmT菌丝体的直径较小（约3μm），表面较粗糙（图3E）。CmT细胞壁的一些区域显示出松散的结构（图3F）。这表明Endo-CM表达的增加导致C.militaria细胞壁结构的异常。

 

图3 Endo-CM启动子上的候选突变位点和转化体菌丝形态示意图

 

4 上调Endo-CM影响菌丝发酵过程和营养成分

研究表明，CmT菌株的生理发酵过程与亲本菌株CmU存在显著差异。CmT的菌丝生物量呈持续增长，而CmU则先升后降，最终CmT的生物量更高（图4A）。在发酵中后期，CmT的肉汤粘度也明显高于CmU（图4B）。与CmU的V形pH曲线不同，CmT的pH值在整个发酵过程中稳步下降（图4C）。关键在于，CmT的葡萄糖消耗速率远慢于CmU，其在第4天仅消耗约25%，而CmU已消耗约80%（图4D）。这种代谢变化与Endo-CM基因的稳定表达有关（图4E），表明该基因启动子已转变为组成型，不再受碳源代谢物抑制的调控。这些修饰使CmT的生物量积累增加，成为生产高消化率真菌蛋白和蘑菇的优良候选菌株。真菌蛋白含量和营养成分是新型蛋白质替代品的重要评价标准。尽管亲本菌株CmU的粗蛋白含量高于CmT，但CmT的总氨基酸（AA）含量更高（图4F）。

 

这一结果表明，CmT细胞壁的完整性受到损害，因为这些成分是真菌细胞壁的关键成分。由于粗蛋白含量是使用凯氏定氮法测量的，甲壳素中的氮可能会使粗蛋白的CmU值升高。CmT菌丝体的能量和脂肪含量高于CmU菌丝体，而灰分含量较低（图4F）。CmT在真菌蛋白生产的营养成分方面是有利的。

 

图4 蛹虫草CmU和CmT摇瓶发酵特性分析

 

5 CmT菌丝体表现出更高的消化率

体外消化试验表明，基因编辑后的CmT菌株，其真菌蛋白的吸附可及性和消化率显著优于亲本CmU（图5）。在胃和肠阶段，CmT的氨基酸（AA）释放比例总体更高（图5A），尤其在肠阶段处理6小时后，其AA释放率（56.53%）显著高于CmU（42.53%）（图5B）。这得益于CmT更高的菌丝体蛋白含量和更低的消化液粘度（图5C），后者促进了混合与消化。消化后，CmT的固体残留物（50.00%）也远少于CmU（69.47%）（图5D），进一步证实了其高消化率。此外，CmT释放的必需氨基酸（EAA）总量更高，占所有释放氨基酸的51.06%（CmU为42.03%），其中赖氨酸浓度是CmU的两倍多（图5E, 图S3）。

 

综上，对Endo-CM启动子的基因编辑不仅提升了CmT的蛋白质含量，还优化了其氨基酸组成，使其成为营养价值更高的真菌蛋白来源这些结果表明，CmT的基因编辑不仅增加了菌丝体中的蛋白质含量，还改变了菌丝体蛋白质的AA组成。

 

图5 C.militaria菌丝体在受刺激的胃和肠阶段的消化率。

 

6 Endo CM的上调导致子实体产量下降

为评估CmT形成子实体的能力，研究将其与对照菌株CmU和CmW进行比较（图6A）。结果显示，CmT形成的子实体更短、更厚、弯曲且数量更少，表明其子实体发育能力部分受损（图6B）。感官和电子舌分析揭示，尽管整体味道特征相似，但CmT的苦味显著弱于CmU，而鲜味则更强（图6C）。这种风味改善源于其菌丝体中关键鲜味氨基酸（Asp, Glu）含量更高，而苦味氨基酸含量仅为亲本菌株的约50%（图S3）。此外，由于CmT消化率更高（图S4）且多糖含量降低，其估算血糖指数（eGI）也显著低于对照菌株（图S5）。研究认为，CmT脆弱的菌丝体和受损的细胞壁干扰了子实体的正常结构。因此，虽然Endo-CM启动子的修饰成功解决了真菌生物量的消化率问题并优化了营养与风味，但要获得形态和产量俱佳的子实体，则需要采用不同的遗传策略，如在子实体形成阶段进行阶段性基因表达。

 

图6 C.militaria子实体的形态和电子舌测量

 

本研究揭示了蘑菇形成真菌分泌的去糖基化酶在维持自体细胞壁完整性中的生物学作用。细胞壁结构的组成和复杂性通过影响蛋白质对消化酶的可及性在消化过程中起着关键作用。这种酶是水解真菌蛋白和子实体的甘露糖蛋白外壳的工具，从而为营养目的提供氨基酸和肽。基因编辑后，工程菌株的菌丝体变得更容易消化，营养增强，口感改善。通过了解Endo-CM的功能，本研究利用基因编辑技术设计和培育了更容易消化和营养增强的蘑菇新种质。这是蘑菇精确设计和繁殖的一个例子。

 

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