PNAS | 云芝和弯孢胶化孔菌对木质素代谢物的胞内降解

序

之前的文章“蘑菇不仅可以降解木质素而且可以利用木质素作为碳源进行生长”介绍了Mirjam A. Kabel团队利用碳13标记的小麦天然木质素作为唯一碳源培养双孢菇菌丝，首次证明了蘑菇可以降解木质素并且利用木质素作为碳源进行生长。而本次介绍的文章发表在Sci Adv文章之前。本文首次用碳13标记证明了木质素代谢产物“4-羟基苯甲酸”可以被云芝等真菌代谢，并且用于合成蛋白氨基酸。但是由于使用的不是天然木质素，因此才有了后续的Sci Adv的文章对“蘑菇能够利用木质素生长”这一结论进行完善（不是一个团队）。

发表期刊：Proceedings of the National Academy of Sciences

通讯作者：Davinia Salvachúa

DOI号：10.1073/pnas.2017381118

摘要

木质素是高分子聚合物，是植物细胞壁中的重要组成成分，占了生物圈中所有生物量的30%。白腐真菌是自然界中降解木质素效率最高的生物。研究者对白腐菌降解木质素的过程进行了大量深入研究，但是白腐菌是否能够利用木质素作为碳源仍不清楚。本研究利用碳13标记技术、系统生物学策略以及胞内酶的分析解析了两种白腐真菌（云芝Trametes versicolor和弯孢胶化孔菌Gelatoporia subvermispora）如何通过胞内代谢将木质素来源的芳香族化合物降解进入核心碳代谢的过程。本研究不仅为土壤的地球化学循环研究提供了新思路，而且为木质素的生物炼制转化为高值化合物提供了重要参考。

真菌可以利用木质素代谢产物作为碳源生长

•  云芝和弯孢胶化孔菌利用对羟基苯甲酸和香草酸作为碳源

图1 推测的三种木质素代谢产物的体内代谢通路

云芝和弯孢胶化孔菌都属于真菌里面的伞菌纲多孔菌目的真菌基因组已经公布。两种真菌木质纤维素降解模式存在差异，云芝会同时降解木质素和多糖，而弯孢胶化孔菌倾向于先降解木质素。作者研究了利用木质素来源的芳香族化合物作为唯一碳源时两种真菌生长。结果表明，以4-羟基苯甲酸（4HBA）为唯一碳源时经过14 d培养，云芝和弯孢胶化孔菌分别降解了48%和76%的4-HBA。在静置培养的过程中，真菌形成了菌丝体和菌丝垫，证明了两种真菌可以利用木质素降解产物作为碳源进行生长。

• 碳13标记实验证明4HBA转化为蛋白氨基酸

图2 胞内氨基酸代谢和氨基酸中碳13富集水平分析

为了确定真菌能够利用4HBA进行生长，作者使用了碳13-标记的底物来评估真菌对4HBA的利用情况。研究中分别采用了碳13标记的4HBA和碳13标记的香草酸作为碳源来培养白腐真菌，此外，为了增加芳香族化合物的转化效率以及菌丝生长速率，培养基中还添加了纤维二糖。可以看到，云芝可以同时转化纤维二糖和芳香族化合物，而弯孢胶化孔菌转化芳香族化合物的速率高于纤维二糖，这与这两种真菌降解木质纤维素的模式是相同的。在胞内，两种真菌都出现了碳13的富集（图2F,G）。在4HBA转化的培养基中，第8天的时候，弯孢胶化孔菌中氨基酸的碳13显著富集（最高12%，图2D,G），4HBA的转化率为60%。而在第6天的时候，云芝对4-HBA的转化率就已经达到了85%，但是分析显示氨基酸中碳13的富集水平并不高（最高5%，图2F）。推测由于云芝同时利用纤维二糖和4HBA，更倾向于利用没有标记的纤维二糖作为碳源，因此碳13富集水平较低。但是弯孢胶化孔菌主要利用4-HBA作为碳源，因此氨基酸的碳13富集水平较高。总体来说，与对照相比较，添加了碳13标记的4HBA和香草酸的培养基中氨基酸碳13富集水平显著升高。证明了云芝和弯孢胶化孔菌能够利用这两个木质素来源的芳香族化合物作为碳源生长。

4HBA的胞内代谢途径分析

• 生信分析预测4HBA代谢途径

根据细菌中的芳香族化合物代谢基因和部分真菌中报道的基因，通过同源比对在两个真菌的基因组中进行序列比对，鉴定到了多个潜在的具有氧化脱羧和水解活性的同源蛋白。通过比对结果推测出来一个完整的4HBA的代谢通路。但是在序列比对中没有发现香草酸和丁香酸的完整代谢的基因。

• 空间多维组学揭示芳香族化合物代谢途径

图3 预测的芳香族化合物胞内代谢途径

在4HBA培养的两个白腐真菌胞内都鉴定到了4HBA，此外在木质素和杨树培养的弯孢胶化孔菌中也检测到了4HBA。此外，在4HBA培养的弯孢胶化孔菌的胞内和胞外还检测到了对苯二酚，1,2,4-苯三酚和原儿茶酸（图3）。根据组学结果，上一步序列比对筛选出的6个氧化脱羧酶（每个白腐菌3个）、2个水解酶（每个白腐菌1个）和6个双加氧酶（云芝2个，弯孢胶化孔菌4个）的基因和蛋白的表达水平在4HBA培养的菌丝中表达量显著高于对照组（下图红圈）。

图4 转录组学和蛋白质组学分析结果以及胞外酶催化验证代谢酶促反应步骤。

根据上面的分析结果，推测4HBA的胞内代谢有两条途径，分别被转化为对苯二酚和原儿茶酸。一个膜结合的氧化脱羧酶可以将4HBA在胞内或者胞外转化为对苯二酚和原儿茶酸。生成的对苯二酚在胞内能够被转化为1,2,4-苯三酚（图3）。同时，原儿茶酸在细胞内通过对羟基苯甲酸的羟基化反应生成。由于在基因组上没有发现原儿茶酸裂解酶，推测原儿茶酸可能通过氧化脱羧反应生成1,2,4-苯三酚。为了验证这些脱羧步骤的存在，作者利用仅在羧基含有碳13同位素标记的4HBA培养白腐真菌，与对照组（未进行碳13标记的4HBA组）相比较，蛋白质氨基酸中的碳13富集水平每没有显著增加。这表明了4HBA中的羧基可能在进入中心代谢途径之前就通过脱羧反应被去除释放了。

• 苯三酚裂解途径是4HBA利用的关键步骤

根据组学分析结果，本研究选择了7个脱羧酶和2个羟化酶来验证功能（图S16）。在大肠杆菌中表达上述基因，利用大肠杆菌裂解液，在添加不同辅酶组合下，验证酶的活性。实验结果显示，除了一个脱羧酶（GS119636）之外，其他的脱羧酶在4HBA和原儿茶酸存在下都能够转化NADH或者NADPH。同时两种羟化酶在4HBA存在下也能够转化NADH和NADPH。

 图S16 筛选的4HBA降解酶的酶活

为了进一步解析4HBA的代谢经，将初筛中显示出活性的酶进行进一步的纯化和功能鉴定。包括两对脱羧酶和一对羟化酶。对于氧化脱羧反应（图3，反应1和5），鉴定到了两个酶TV_32834和GS_120062可以分别催化原儿茶酸和4HBA。对于羟基化反应（图3，反应2和4），TV_58730和GS_82057均能催化对苯二酚，推测生成苯三酚。本研究还评估了环裂解双加氧酶的活性（图3，反应6和7），2个蛋白能够获得可溶性的蛋白（TV_28066和GS_116134）。这两个酶在苯三酚作为底物的时候能够消耗分子氧（图4D），在邻苯二酚、对苯二酚和原儿茶酸作为底物的时候，这两个酶几乎不消耗氧气，这说明了苯三酚是它们的最优底物。

讨论

在传统认知中，白腐真菌是否能够利用木质素作为碳源和能源始终不明确。本研究利用碳13标记的芳香族化合物证明了云芝和弯孢胶化孔菌能够利用4HBA和香草酸作为碳源。证明了这些化合物会进入到蛋白质氨基酸中。本研究利用系统生物学和系统发育分析来分析了两个菌株中4HBA可能的代谢途径和相关的基因，两个菌株中同源蛋白的表达趋势基本相似。根据酶活和组学结果综合分析认为在弯孢胶化孔菌中4-HBA主要代谢途径是经由氧化脱羧反应生成对苯二酚，随后再羟基化为苯三酚，后者进行开环反应。在云芝中，4-HBA则更倾向于首先羟基化生成原儿茶酸，然后再经由氧化脱羧反应转化为苯三酚（图3）。基于提出的4HBA的转化途径，本研究认为来自于芳香环的碳可能会被保留在细胞内，其中一部分被整合到真菌生物质中，来自于羧基的碳泽汇以CO2的形式进入到大气中。本研究通过基因组学与系统生物学研究了白腐真菌芳香族化合物的降解过程，为木质素降解未来的研究提供了新的思路和参考。