在全球“减盐不减味”的健康需求背景下，高盐饮食引发的高血压、心肾损伤等问题已成为公共卫生领域的重要挑战。世界卫生组织（WHO）建议成人每日盐摄入量不超过5g，而《中国居民膳食指南（2022）》指出，我国居民日均盐摄入量达9-11g，仅约20%人群符合WHO标准。开发天然、安全的咸味增强剂成为食品科技领域的研究热点，其中源于动植物的咸味肽因兼具安全性与功能性，被视为理想的盐替代品。香菇（Lentinula edodes）作为全球主栽食用菌，不仅富含蛋白质、肽类等营养成分，其酶解提取物还被证实具有鲜味增强作用，但在咸味肽的分子鉴定与增咸机制方面仍缺乏系统研究。为此，上海市农业科学院食用菌研究所研究团队在《LWT - Food Science and Technology》（IF 6.6，中科院1区）发表文章“Saltiness enhancing peptides isolated from enzymolysis extract of Lentinula edodes and their taste enhancing action mechanisms”，该研究通过多学科技术融合，从香菇连续酶解提取物中筛选出咸味增强肽，并揭示其与味觉受体的相互作用机制，为食用菌基减盐调味品开发提供了关键理论与技术支撑。

一、多维度协同解析咸味肽特性

为系统挖掘香菇中的咸味增强肽，研究团队构建了“提取-分离-鉴定-验证-机制解析”的完整技术链，各环节紧密衔接，确保结果的可靠性与逻辑性。

1、香菇酶解提取物的制备。研究采用实验室优化方案，将香菇子实体粉碎过80目筛后，按1:30的料液比与蒸馏水混合，先经风味蛋白酶（1000 u/g，pH 7.0，50℃）酶解45分钟，沸水浴灭活10分钟；再加入胰蛋白酶（3000 u/g，pH 8.0，37℃）继续酶解45分钟，再次灭活后离心（4℃，8000 rpm，10分钟）收集上清，通过3kDa超滤柱截留小分子组分（命名为LEE），冷冻干燥备用。这一步骤通过双酶连续水解，可高效释放香菇蛋白中的小分子肽，且3kDa以下的组分更易被味觉细胞感知，为后续咸味肽筛选奠定基础。

2、通过凝胶过滤色谱（GFC）对LEE进行组分分离。采用Sephadex G-15凝胶柱，以去离子水为洗脱液（流速0.75 mL/min），在220nm处监测紫外吸收，收集到4个组分（P1-P4）。为确定核心活性组分，研究同步开展感官评价与电子舌分析：感官小组由10名经训练的健康人员（22-26岁，4男6女）组成，以3.0g/L NaCl溶液的咸味评分为5分（浓度每增减1.0g/L，评分增减2分），结果显示P2组分的咸味评分最高（6.8分），且兼具轻微鲜味与甜味（表1）；电子舌的主成分分析（PCA）进一步验证（图1C），前两个主成分（PC1和PC2）的累积贡献率达97.41%，可解释大部分味觉信息，且P2在咸味维度上的投影与高浓度NaCl（4g/L）高度重合，同时P2的肽含量达524.87mg/g（表1），综合这些结果，P2被确定为后续研究的核心组分。

图1 A:香菇酶解提取物（<3 kDa）的凝胶过滤色谱图；B:GFC组分（1g/L）的感官评价；C:电子舌对GFC与不同浓度NaCl溶液的PCA分析

表1 GFC组分的感官评价与肽含量分析

a同一列中带有不同字母标记的数值存在显著差异(P<0.05)

3、为进一步阐明P2组分中的呈味肽，通过LC-MS/MS技术鉴定了肽段的分子量及氨基酸序列。先经Ziptip C18柱脱盐（60% ACN/0.1% TFA洗脱），再用Thermo Ultimate 3000 UPLC-Q Exactive Plus质谱仪分析，共鉴定出1167条肽段，分子量分布为647-2110Da（图2B），其中七肽至十肽是主要组分，占肽数量的12.9%-33.2%、MS信号区的14.5%-27.5%（图2A），且前体蛋白以A0A1Q3E953_LENED为主。为筛选出具有咸味潜力的肽，研究使用BIOPEP-UWM在线工具（感官肽与氨基酸模块）对数据库中497条肽段的呈味特性进行预测，最终筛选出272个具有咸鲜特性的肽段，其中七肽数量最多（59条），长链肽（如十一肽至十八肽）虽数量较少，但具有咸鲜特性的肽段MS信号占比更高（28.19%-46.85%），这表明其对P2的味觉贡献同样重要。基于预测评分，研究选择4个咸鲜味评分最高的肽（ADHDLPF、DIQPEER、DEPLIVW、LPDEPSR）进行固相合成，用于后续活性验证与机制研究。

图2 P2组分中质谱（MS）信号区（A，内层）与肽段数量（A，外层）情况，7P-19P表示七肽至十九肽。未标记信号占比<1%，分子量分布见（B）。

4、通过感官评价、阈值测定与电子舌分析评估合成肽的咸味特性：感官评分显示DEPLIVW的咸味最强（7.2分），其次为DIQPEER（6.3分）；阈值测定采用三角试验法，结果显示4个肽的阈值（0.144-0.516mM）均低于NaCl（1.07mM），其中DEPLIVW阈值最低（0.144mM），表明其对咸味的感知更敏感。为揭示增咸机制，研究采用分子对接与分子动力学模拟技术：分子对接使用MOE 2023软件，TMC4受体（新型氯离子通道，响应高浓度NaCl，含8个跨膜区）的结构通过AlphaFold2等AI工具构建并优化（图3A、B），结果显示4个肽均可与TMC4的两个变构口袋（Pocket1、Pocket2）结合（图3C-F、c-f），且Pocket1的对接能更低（如DIQPEER为-10.9988kcal/mol），结合更稳定，关键结合位点为Pocket1的Arg583、Arg294与Pocket2的Arg437、Gln527，氢键是主要作用方式（如DIQPEER与Pocket1形成9个氢键）；分子动力学模拟采用GROMACS 2020.3软件，进行50ns模拟，结果显示复合物在10ns后达到平衡，RMSD（8.33-10.46Å）、RMSF（大部分<2.5Å）与Rg（29.71-32.81Å）均表明肽与TMC4结合稳定且结构紧凑，氢键数量（6-11个）与对接结果一致，进一步验证了结合模式的可靠性。

图3 A: 咸味受体TMC4的结构及其结合口袋；B: 使用TMHMM-2.0服务器预测的跨膜区域；C-F: 肽段ADHDLPF（C）、DEPLIVW（D）、DIQPEER（E）、LPDEPSR（F）与TMC4 pocket1的分子对接结果；c-f: 四种肽段与TMC4 pocket2的分子对接结果。

5、通过电子舌分析合成肽的盐替代效果：将不同浓度（0.5-2.0g/L）的合成肽加入2.0-3.5g/L NaCl溶液中，以4.0g/L NaCl为标准，结果显示当1.0g/L肽与3.0g/L NaCl复配时，增咸效果最佳（图4B），其中DIQPEER的盐增强率达69.59%，可替代50% NaCl，DEPLIVW与ADHDLPF可替代37.5%，LPDEPSR可替代25%，证实这些肽能通过协同作用提升NaCl的咸味，实现“减盐不减味”。

图4 A: 电子舌测定不同浓度合成肽的咸味强度；B: 电子舌测定合成肽与NaCl溶液的协同效应

二、核心研究结果：咸味肽的特性与增咸机制

1、P2组分的味觉与分子特征

GFC分离结果表明，香菇酶解提取物（LEE）的4个组分中，P2是唯一兼具高咸味、高肽含量与良好味觉协调性的组分（表1）：其肽含量为524.87mg/g，虽低于P1（563.29mg/g），但味觉表现更优——P1因兼具酸味与苦味（评分4.40），味觉纯度较低；P3、P4则分别以甜味、苦味为主，咸味评分仅3.70、2.70。LC-MS/MS分析进一步揭示了P2的分子优势：1167个肽的分子量集中在647-2110Da，这一范围的小分子肽更易通过口腔黏膜与味觉受体结合；七肽至十肽的主导地位（数量占比12.9%-33.2%）与氨基酸组成特征（N端富含D、G、L、P，C端富含R、K，疏水氨基酸占比高），为其咸味特性提供了结构基础——疏水氨基酸可增强肽与受体的疏水相互作用，而碱性氨基酸（R、K）则可能通过静电作用参与咸味信号传递。

2、合成肽的咸味活性与盐替代能力

4个合成肽的活性验证结果显示，其咸味特性存在显著差异，但均优于传统NaCl：从咸味强度看，DEPLIVW（7.2分）>DIQPEER（6.3分）>ADHDLPF（4.40分）>LPDEPSR（3.30分）；从感知敏感性看，阈值顺序为DEPLIVW（0.144mM）<DIQPEER（0.282mM）<ADHDLPF（0.307mM）<LPDEPSR（0.516mM），均远低于NaCl的1.07mM，说明这些肽能在更低浓度下被感知，可有效降低总盐用量。盐替代实验进一步证实了其应用价值：当肽浓度为1.0g/L时，与3.0g/L NaCl复配后的咸味强度可接近甚至超过4.0g/L NaCl，其中DIQPEER的效果最显著，能将NaCl用量从4.0g/L降至2.0g/L（替代50%），且不引入明显异味——这一结果与发酵豆腐中咸味肽（EDEGEQPRPF）的研究结论一致，表明天然来源的咸味肽在减盐食品中具有普适性应用潜力。

3、与TMC4受体的相互作用机制

分子对接与分子动力学模拟共同揭示了咸味肽的增咸机制：TMC4作为高浓度NaCl的关键味觉受体，其两个受体结合位点（Pocket1、Pocket2）是咸味肽的作用靶点。从结合稳定性看，Pocket1的对接能普遍低于Pocket2（如ADHDLPF在Pocket1为-10.0897kcal/mol，Pocket2为-10.0645kcal/mol），说明Pocket1是更主要的结合位点；从作用方式看，氢键是核心相互作用，4个肽与Pocket1形成的氢键数量（6-9个）多于Pocket2（3-9个），且关键位点（如Arg294、Arg437）的胍基可与肽的羧基形成强氢键，增强结合稳定性；从结构动态性看，50ns分子动力学模拟显示，肽与TMC4结合后，蛋白的RMSF大部分低于2.5Å，表明受体结构更稳定，不易发生构象变化，从而持续传递咸味信号——这一机制补充了现有研究中“TMC4介导咸味感知”的理论，明确了天然肽与TMC4的结合模式，为后续咸味肽的分子设计提供了靶点依据。

三、研究意义与应用前景

该研究不仅在理论层面填补了香菇咸味肽分子机制的空白，还在技术层面为减盐调味品开发提供了可行方案，其创新点与价值主要体现在三个方面：

1、明确了香菇作为咸味肽来源的优势。香菇作为全球产量最大的食用菌之一，原料易得且成本较低，此前研究多聚焦其鲜味肽，而本研究首次系统鉴定出4个高活性咸味肽，证实香菇酶解提取物可同时提供鲜、咸两种核心味觉，为多功能调味品开发提供了新原料，拓展了食用菌的深加工方向。

2、建立了“分离-预测-验证-机制”的咸味肽研究范式。研究整合了GFC（组分分离）、LC-MS/MS（肽鉴定）、BIOPEP-UWM（虚拟筛选）、分子模拟（机制解析）等多技术，特别是通过AI工具（AlphaFold2）构建TMC4受体结构，解决了传统同源建模中模板一致性低（<30%）的问题，提高了分子对接的可靠性——这一范式可为其他天然原料（如大豆、水产品）中咸味肽的研究提供参考。

3、为减盐食品工业提供了实用技术参数。研究明确了4个肽的最佳应用浓度（1.0g/L）与盐替代比例（25%-50%），可直接指导减盐酱油、调味酱等产品的配方设计，例如在酱油中添加1.0g/L DIQPEER，可将NaCl用量从15%降至7.5%，且咸味强度保持不变，既符合健康需求，又兼顾消费者味觉体验。

未来，基于该研究结果，可进一步开展三个方向的研究：一是优化酶解工艺，提高4个咸味肽的产量；二是通过分子改造（如定点突变）增强肽的咸味活性，降低阈值；三是开展动物实验与人体临床试验，验证肽的长期食用安全性——这些研究将进一步推动香菇咸味肽从实验室走向产业化应用，为全球减盐行动提供中国方案。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.lwt.2023.115430