近日，上海市农业科学院食用菌研究所加工团队采用基于RNP的 CRISPR/Cas9基因编辑体系，在灵芝单核菌株中实现精准基因编辑，并通过转入供体DNA完成同源重组修复，经单单杂交，成功获得灵芝基因位点纯合的双核编辑菌株。利用该技术体系鉴定出灵芝三萜生物合成关键cyp450基因——cyp512a3，并结合系统进化关系与代谢表型分析，预测了该基因参与的三萜生物合成的通路。本研究首次在灵芝内源系统中验证cyp450基因的功能，克服了异源表达系统的固有局限。所建立的双核基因编辑技术路径，为其他食用菌的基因功能研究提供了可借鉴的范式。相关研究成果已发表于Journal of Fungi（二区，IF：4.0）。

灵芝富含三萜、多糖、核苷、生物碱、甾醇等多种活性成分，具有免疫调节、抗氧化、抗肿瘤及保肝等多重生物活性。其中，酸性三萜（灵芝酸）作为灵芝三萜的重要亚型，已有大量研究证实其具有诱导宫颈癌细胞凋亡、促进血小板聚集、诱导肺癌细胞凋亡、抑制肿瘤生长及肺转移等多种功能。细胞色素 P450（CYP450）超家族作为关键氧化酶，在灵芝三萜结构多样化过程中发挥重要作用。目前，已有部分cyp450基因在异源表达系统中被证实参与三萜生物合成途径。然而，这些异源系统所能合成的灵芝酸并非灵芝中的主要灵芝酸类型，其固有的局限性使其无法真实模拟灵芝体内的天然代谢环境。因此，直接在灵芝内源体系中开展cyp450基因功能研究，对于系统解析灵芝酸的生物合成机制具有不可替代的必要性。此外，目前已报道的食用菌基因编辑体系多以单核菌株为研究材料，而单核生长状态无法真实反映灵芝子实体发育过程中三萜的合成规律。因此，在双核菌株中建立稳定高效的基因编辑体系，并针对关键cyp450基因开展内源功能验证，对阐明灵芝三萜的生物合成机制具有重要理论价值与研究意义。

图1 cyp512a3单核编辑菌株的获得

图2 cyp512a3编辑菌株的单单杂交

图3 cyp512a3过表达菌株的获得

本研究在灵芝单核菌株中利用基于RNP的CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，并通过转入供体DNA实现同源重组修复，随后经单单杂交，成功获得灵芝基因位点纯合的双核编辑菌株G0119-KOcyp512a3。与野生型相比，该敲除菌株中8种灵芝酸含量显著下降，降幅达30.5%–80.1%。与此同时，在单核过表达菌株 L1-OE-cyp512a3中，4种灵芝酸含量较野生型显著上调，为野生型的1.3–1.5倍。系统发育分析表明，cyp512a3与已鉴定的基因（cyp512w2、cyp512a2、cyp512a13）进化亲缘关系紧密；结合灵芝酸代谢变化，进一步推测cyp512a3作用于 HLDOA下游的代谢节点。本研究为获得两个细胞核均被编辑的灵芝双核纯合编辑菌株提供了切实可行的解决方案，为探索灵芝酸生物合成途径和基因功能提供了重要工具。

图4 G0119-KO-cyp512a3和L1-OE-cyp512a3菌株发酵菌皮的灵芝酸含量检测

图5 G0119中的CYP基因系统进化树

图6 灵芝三萜生物合成途径预测

上海海洋大学联培研究生董蓓蓓和上海市农业科学院食用菌研究所加工团队谭贻实验师为论文的第一作者，张劲松研究员和唐传红研究员为通讯作者。该研究获得了国家重点研发计划(批准号:2023YFF1000800)的资助。