一种新的灵芝酸性多糖的分离、结构鉴定及免疫调节活性

暨南大学中药生物技术研究所：Man Zhang和Jixu Wu和Xuqiao Hu（共同第一作者），朱建华教授和Haining Tan和于荣敏教授（共同通讯作者）在期刊《International Journal of Biological Macromolecules》（IF：8.5）上发表了题为“Isolation, structural characterization and immunoregulatory activity of a novel acidic polysaccharide from Ganoderma sinense”的论文。

01 研究背景

就人类免疫系统而言，巨噬细胞是单核巨噬细胞系统的关键成分，在免疫过程中发挥着重要作用，特别是在防御病原体入侵方面。巨噬细胞能够识别入侵病原体上的病原体相关分子模式(PAMP)，并在其表面呈现微生物抗原，从而启动后续的免疫反应。已知这些细胞是通过模式识别受体感知的，包括位于细胞膜或细胞质内的大量Toll样受体(TLRs)。近年来，真菌多糖作为一种生物活性化合物的来源，在开发新型药物和保健饮食方面受到了极大的关注。真菌多糖在临床上有很长的使用历史，例如北冬虫夏草、冬虫夏草和香菇，这些物种已被报道具有增强免疫的特性，证明了这一点。因此，真菌多糖已被公认为是开发免疫增强剂的有前途的候选者。

中华灵芝是一种很有市场和前景的食用菌，主要是因为它的治疗作用，包括滋气，安神，止咳和哮喘。灵芝中的多糖是其主要活性成分之一，也是最常用的药用成分。已有研究表明，从灵芝中提取的多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化等作用。然而，现有的文献表明，灵芝多糖的免疫活性主要是基于粗多糖提取物。仅仅通过对这些物质的研究来确定粗多糖活性的物质基础是具有挑战性的，因为它们的组成可能包括各种均质多糖以及杂质。

多糖是一类高度流行的天然生物聚合物，其特点是毒性低、副作用少、药理活性广泛。一般来说，多糖的分类取决于分子中存在的带电基团。多糖可以分为三种不同的类型：中性、带负电荷(酸性多糖)和带正电荷的多糖。酸性基团的存在，如糖醛酸和硫酸盐，对酸性多糖的溶解性和生物活性至关重要。例如，从菊花中分离得到两种酸性多糖GJP-1和GJP-2。对其免疫调节活性进行了评估。结果表明，这些多糖具有相似的单糖组成，但摩尔比不同。与GJP-1相比，GJP-2的GALA含量较高，达48.52%。研究表明，GJP-2具有较高的免疫刺激活性，这一特性与其成分中GALA的存在有关。研究发现从秀丽隐杆线虫中分离得到的酸性多糖SBP-3A通过上调抗氧化剂相关基因daf-16和SKN-1的表达，下调AGE-1的表达，具有显著的抗氧化活性。然而，目前国内外关于灵芝酸性多糖的提取、纯化及结构鉴定的报道较少，这阻碍了食用菌的综合利用。

02 研究方法与结论

该研究首次采用模拟胃液提取法成功分离纯化了三种灵芝多糖GSPA60-1、GSPA60-2和GSPA60-3。用常规的层析方法和光谱技术对多糖进行了表征。这三种多糖在形态、相对分子质量和单糖组成上有明显的差异。系统评价了这些多糖的免疫调节作用。生物活性测定表明，GSPA60-3比GSPA60-1和GSPA60-2具有更强的免疫调节作用，这促使人们对其结构和性质进行进一步的分析。GSPA60-3主要由→6)-β-D-GLCP-(1→，→3，6)-β-D-GLCP-(1→，→4)-β-D-MANP-(1→残基，末端为β-D-GlcpA-(1→组成。体外实验表明，40μg/mLGSPA60-3可显著增强RAW264.7细胞的吞噬功能，促进细胞分泌NO、iNOS、TNF-α、IL-6和IL-1β。GSPA60-3通过TLR2/TLR4和MAPK/AKT/NF-κB信号通路激活巨噬细胞。研究结果表明，GSPA60-3是一种定义明确的酸性多糖，具有显著的免疫调节作用，表明其作为膳食补充剂具有提高免疫功能和预防癌症的潜力。

03 创新点

（1）通过模拟胃液分离出新型酸性灵芝多糖（GSPA60-3）；

（2）GalA最早在G.sinense的多糖中被发现，并鉴定了其结构；

（3）GSPA60-3（9448 Da）含有1,4-甘露糖（Manp）、1,6-葡萄糖（Glcp）、1,3,6-葡萄糖（Glcp）和末端葡萄糖（T-Glcp）;

（4）GSPA60-3通过增强增殖、吞噬作用和细胞因子分泌来增强免疫活性；

（5）GSPA60-3通过激活MAPK/Akt/NF-κB信号通路，具有强效的免疫调节活性。

04 图文赏析

Fig. 1. Polysaccharides derived from G. sinense. The fractionation and purification scheme for GSPA60-n (a), DEAE-52 elution curve (b), Elution curve of GSPA60-1 on Superdex-100 column (c), Elution curve of GSPA60-2 on Superdex-100 column (d), Elution curve of GSPA60-3 on Superdex-100 column (e).

Fig. 2. SEM images of GSPA60-n. GSPA60-1 with the magnifications of 1 k × (a) and 2 k × (b); GSPA60-2 with the magnifications of 1 k × (c) and 2 k × (d); GSPA60-3 with the magnifications of 1 k × (e) and 2 k × (f).

Fig. 3. AFM image of GSPA60-n. AFM planar image (a) and cubic image (b) of GSPA60-1, AFM planar image (c) and cubic image (d) of GSPA60-2, AFM planar image (e) and cubic image (f) of GSPA60-3.

Fig. 4. Physicochemical analysis of GSPA60-n. HPGPC chromatogram (a), UV spectrum (b), FT-IR spectrum (c), HPLC chromatograms of standard monosaccharides (d), HPLC chromatograms of GSPA60-n (e). (1, Man; 2, Rib; 3, Rha; 4, GlcA; 5, GalA; 6, GlcNAc; 7, Glc; 8, GalNAc; 9, Gal; 10, Xyl; 11, Ara; 12, Fuc).

Fig. 5. 1D/2D NMR spectra of GSPA60-3. 1H NMR (a), 13C NMR (b), COSY (c), HSQC (d), HMBC (e), NOESY (f).

Fig. 6. Effects of GSPA60-n on RAW264.7 macrophages that stimulate the immune system. Effect of GSPA60-n on viability of RAW264.7 cells (a), Effects of GSPA60-n on the secretion of NO (b), Effects of GSPA60-3 (40 μg/mL) on the secretion of NO (c), Effects of GSPA60-3 treatment on iNOS levels in RAW 264.7 cells (d). Data are presented as mean ± SD. ⁎p < 0.05, ⁎⁎p < 0.01, ⁎⁎⁎p < 0.001 vs. control.

Fig. 7. Effect of GSPA60-3 on the phagocytic capacity and production of cytokines. The effect of GSPA60-3 on secretion of TNF-α (a), IL-1β (b) and IL-6 (c) of RAW264.7 cells, The neutral red uptake (d), Cellular uptake of FITC-labeled by RAW264.7 cells analyzed by flow cytometry (e). Data are presented as mean ± SD. ⁎p < 0.05, ⁎⁎p < 0.01, ⁎⁎⁎p < 0.01 vs. control.

Fig. 8. Effect of GSPA60-3 pretreatment on the expression of related proteins in RAW264.7 cells. The expression levels of TLR-2 and TLR-4 (a), ERK, JNK, and p38, as well as their phosphorylation after GSPA60-3 treatment in RAW264.7 cells (b), AKT and mTOR as well as their phosphorylation after GSPA60-3 treatment in RAW264.7 cells (c), NF-κB as well as their phosphorylation after GSPA60-3 treatment in RAW264.7 cells (d), were measured by Western blot analysis.

Fig. 9. Effects of GSPA60-3 on the MAPK/AKT/NF-κB signaling pathway. RAW264.7 cells were pre-treated with or without specific inhibitors for 2 h and incubated with 40 μg/mL of GSPA60-3 for 24 h, then NO production was detected by Griess reagent and TNF-α, IL-1β, and IL-6 production was detected by ELISA assay. Data are presented as mean ± SD. ##p < 0.01, ###p < 0.001 vs. control. ⁎⁎p < 0.01, ⁎⁎⁎p < 0.001 vs. GSPA60-3.

Fig. 10. Schematic diagram illustrating the molecular mechanism underlying immune regulation by GSPA60-3.

基金支撑：

该研究得到了广州市科技计划项目(编号：202201010107,2023A03J0613)、糖类药物质量研究与评价国家重点实验室开放项目基金(编号：2023QRECM04)、广东省基础与应用基础研究基金(编号：2023A1515012077)、广东省自然科学基金(编号：2024A1515010301)的资助。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2026.151196