羊肚菌（Morchella spp.）是备受推崇的可食用和药用菌类，其食用和烹饪价值在世界各地有着悠久的历史。它们独特的外观、独特的鲜美风味以及显著的生物活性，促使全球科学家致力于其驯化和大规模栽培的研究。成功的栽培在很大程度上取决于易结实品种的开发以及外源营养补充策略的实施。尽管土壤条件对羊肚菌的栽培至关重要，但这种依赖性不可避免地导致了连作障碍（CCO），即所谓的土壤病害或重茬病，指的是在同一块土地上反复种植同一种植物而导致的作物产量和活力下降。连作障碍现象涉及多种因素的复杂相互作用，包括土壤中病原体和害虫的累积、养分失衡、土壤物理化学结构的退化以及植物残体释放的自毒化感物质的积累。连作障碍现象已在许多作物和其他依赖土壤的栽培真菌中被观察到，包括灵芝、红托竹荪、长根菇以及药用真菌猪苓等。在羊肚菌中，连作障碍表现为子实体产量急剧下降、后续栽培周期中菌丝定殖不良、土壤微生物群落结构改变以及土壤病原体丰度增加。在中国，羊肚菌产业已达到每年约 3万吨（鲜菌）的产量，直接经济价值约 40 亿元人民币，因此有效解决连作障碍问题已成为当务之急。

CCO也被称为土壤病害或重茬病害，植物系统中的 CCO 已经得到了广泛的研究。作为自然和农业生态系统中植物与土壤负反馈（NPSF）的典型表现，CCO 可以被定义为土壤条件的自我恶化，这种恶化抑制了生物体的生长和繁殖。物种特异性 NPSF 或 CCO 的可能机制包括养分缺乏、土壤病原体的积累以及枯枝落叶的自毒作用。然而，农业中长期存在的 CCO 往往表现为高度的物种特异性抑制，这不能仅用养分耗尽或病原体积累来完全解释。此外，土壤中低分子量化感化合物（如短链有机酸、单宁和酚类）的短存期（几周或几个月）与 CCO 的长期持续性（通常为数年）形成了鲜明对比。在此背景下，高等植物细胞外自身 DNA（esDNA）的物种特异性抑制作用为自毒作用假说与 CCO 的发生提供了一个令人信服的解释框架。

本研究从羊肚菌菌丝体和植物中提取了DNA 样本，使用超声破碎仪进行超声破碎，以达到平均约 200 个碱基对的大小，分析了细胞外自体 DNA（esDNA）短片段（≤250 碱基对）或细胞外源 DNA（exDNA）对六妹羊肚菌（Morchella sextelata）和七妹羊肚菌（Morchella eximia）菌丝生长的影响。这些效应通过反应指数（RI）进行量化。

图1. 菌株特异性自毒作用（反应指数，RI）中，外源DNA对羊肚菌菌株菌丝生长的影响，以植物DNA作为远缘相关对照。图（A-C）分别对应M. eximia菌株7A6-2、J7和SK，而图（D、E）则对应M. sextelata菌株LB-2和13。不同处理间的显著差异用不同字母表示（邓肯多重极差检验，p < 0.05）。

在所有六种试验浓度下（RI > 0），所有五种受试羊肚菌菌株的菌丝生长均受到植物来源DNA片段的促进（图1），这表明植物DNA片段可能被羊肚菌菌丝吸收并作为营养源利用。相比之下，在所有试验浓度下（RI < 0），在受试的M. eximia菌株中，J7菌株（图1B）和SK菌株（图1C）均观察到esDNA的剂量依赖性菌株特异性生长抑制作用。此外，在M. eximia 7A6-2（图1A）和两种受试的M. sextelata菌株（LB-2和13）（图1D、E）中，esDNA在最低试验浓度（0.01 μg/mL）下促进菌丝生长（RI > 0），而所有其他浓度均导致生长抑制（RI < 0），总体反应模式类似于毒物兴奋效应。然而，在中国商丘栽培基地，当羊肚菌栽培接近完成时测得的当地土壤DNA含量（1.971μg/g）下，esDNA对所有受试羊肚菌菌株的菌丝生长的影响始终具有菌株特异性和抑制性（图1）。这些结果明确证实了可栽培羊肚菌中esDNA的菌株特异性和剂量依赖性自毒作用。

图2. 不同浓度（0、0.01、0.1、0.5、1.0、3.0、5.0μg/mL）的细胞外自体 DNA（esDNA）对 M. sextelata 13 和 M. eximia 7A6-2 菌落形态的影响，以及植物细胞外源exDNA 对 M. sextelata 13 的影响。图（A）显示培养 3 天后的菌落形态，图（B）显示培养 7 天后的菌落形态。实验浓度标注在培养皿下方。

同种自毒作用通常表现为在低浓度下刺激，在高浓度下抑制。例如，在第 7 天，对于 M. sextelata 13 和 M. eximia 7A6-2，观察到在低浓度（0.01μg/mL 和 0.1μg/mL）下 sclerotia（菌核）产量增加，而在高浓度下，除了生长速度减慢（图 2A）外，菌落还表现出明显的边缘不规则（图 2A）并且无法产生菌核（图 2B）。除了径向生长的减缓之外，esDNA 暴露还导致了菌落形态的显著变化。在抑制浓度（≥0.5μg/mL）下，菌落的边缘变得不规则，菌丝体的结构也变得不紧凑、更加分散，与对照组中密集的圆形菌落相比，差异明显（图 2A）。此外，在高浓度的 esDNA 条件下，子实体的形成明显受到抑制或延迟（图 2B）。这些形态变化表明，esDNA 不仅影响菌丝体的扩展，还影响其活力和分化能力。

本研究为大型真菌（尤其是栽培羊肚菌）中外源DNA（esDNA）诱导的同种自毒作用提供了初步证据。这一发现揭示了一种先前未被认识到的土壤病害机制，该机制与之前报道的酚酸化感作用不同。本研究观察到的保守自毒反应，包括低浓度下的激素效应，强烈表明esDNA在羊肚菌中起着损伤相关分子模式（DAMP）的作用。这与植物中提出的机制一致，即esDNA感知可触发一系列防御反应，如活性氧（ROS）爆发、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）激活以及水杨酸（SA）和茉莉酸的产生和信号传导。从促进到抑制的剂量依赖性转变可能反映了从启动信号到全面、抑制生长的免疫反应的转变。另一方面，DNA损伤应答（DDR）途径已被确定在触发依赖SA的植物对exDNA的防御反应中发挥作用。本研究发现，同源DNA对M. eximia和M. sextelata菌丝生长的抑制作用具有不对称性。其潜在机制仍有待揭示。

esDNA 的自毒作用展现出一种极具吸引力的生态和进化视角。在自然环境中，这种现象可能作为一种与密度相关的负反馈机制发挥作用，防止单一基因型对单一物种的绝对统治，并促进空间异质性和遗传多样性。事实上，越来越多的证据支持这样一种观点，即释放到土壤中的同种esDNA 可以抑制同一物种的生长，从而限制同种生物的繁殖，并促进不同物种或基因型的共存。在这种情况下，esDNA 的积累可以为关系较不密切或不同的物种提供竞争优势，从而促进生态系统的生物多样性。然而，在典型的农业种植中那种高密度、单一菌株的条件下，这种自然选择的自我抑制机制变得不适应，直接导致与 CCO 或“土壤病”相关的重大经济损失。

本研究首次揭示了esDNA 的菌株特异性及同种自毒作用，以及同类exDNA 对可栽培的 M. eximia 和 M. sextelata 的菌丝生长的不对称抑制作用。其潜在机制可能涉及保守的 DAMP 和 DDR 通路，这需要进一步的分子研究来证实。这些发现有助于更深入地理解羊肚菌地栽过程中的 NPSF（土壤病害）问题，并强调了缓解 CCO 的潜在应用价值。从实际角度来看，本研究结果表明，在先前种植过 M. sextelata 株系的田地重新种植 M. eximia 株系的风险低于相反的情况，这有利于羊肚菌的实用生产。此外，诸如深耕、土地淹灌和土壤消毒等农艺措施，能够促进持久的 esDNA 的降解或去除，应优先采用以减轻羊肚菌的 CCO。开发加速土壤中细胞外 DNA 降解的方法可能是一种克服羊肚菌种植中 CCO 的新策略。