序

花了7年时间追踪蘑菇圈，对上百份蘑菇样品进行了基因组测序，实验过程并不复杂，数据量也不大，但是思路非常独特，很明显打破了我对于蘑菇遗传的认知。虽然按照文章的结果可以推导出文章的结论，但是因为跟传统认知有差异，总是不能完全理解，果然Science就是与众不同。为了避免自己水平不足造成大家理解有问题，所以没有删减。

发表期刊：Science

通讯单位：Stockholm University

DOI号：10.1126/science.adu8580

摘要

在有性生殖的生物中，新突变的遗传特性高度依赖于生殖细胞系确定的时间。本研究以蘑菇硬柄小皮伞作为实验材料，对真菌界生殖细胞晚期分离的这一普遍认知提出了挑战。7年间，采集了仙女环不同部位的蘑菇样本，采用全基因组测序鉴定了不同组织中产生的新的突变。研究发现可育组织（产孢组织）与不育组织积累了不同的突变。这表明了该物种中与孢子产生有关的生殖细胞系在菌丝体阶段已经确立。此外，研究发现生殖细胞携带的突变的数量少于不育组织，这表明了生殖细胞的突变率更低。这些发现表明生殖细胞早期隔离现象在多细胞生物中的普遍性可能远超既往认知。

真菌生殖细胞的确立时间研究

前言

在19世纪晚期，奥古斯特·魏斯曼提出只有生殖细胞才能够将遗传信息从上一代传递给下一代。从那之后，人们普遍认为，个体性生物，也就是那些发育程序可以预测并确定的生物体，在发育的早期阶段其生殖细胞系就已经确定。在这些生物中，只有生殖细胞系中产生的变异在进化上才有意义，因为体细胞中产生的变异会随着个体死亡而消失。相反，在真菌、植物和非两侧对称的动物中，普遍认为生殖细胞系是在生长发育的晚期才会被确立，在时间上接近配子形成的时间。因此，在生长发育过程中产生的变异就会进入到生殖细胞系中。这些生物中有许多属于构件生物，该类生物的发育和形态结构具有不可预测性，由重复的单元或者模块组成生物体。在构件生物中，生殖组织的发育必然是发生在生活史的晚期，因为在每一个模块中都必须存在一个全能干细胞，这个细胞能够产生体细胞，并最终形成生殖细胞系。然而，真菌的生殖特征表现出显著的多样性，现有证据表明，目前的生殖模型对于真菌而言过于简化。

理论上认为，对于多细胞生物而言在发育早期出现生殖细胞系的隔离具有至少两个优势。首先，在发育早期阶段就确定细胞的命运能够降低不同细胞之间的竞争风险，从而稳定多细胞之间的内部协作关系。其次，这种隔离会形成一个稳定的环境保护生殖细胞系中的遗传物质在世代传递过程中保持完整性。因为大部分的突变对于环境适应都是有害的，因此在生殖细胞系中较低的突变率被认为是具有选择优势的特征。近些年，来自动物研究的经验表明，生殖细胞系的突变率低于体细胞的突变率。有观点指出，生殖细胞系的早期隔离是两侧对称动物的一个衍生性状，而最初的祖先的生殖细胞系在个体发育后期才被定义。在非两侧对称的动物、植物和真菌中，祖先的这种生殖细胞系发育模式被保留了下来。最近的研究结果表明，生殖细胞系的隔离发生在生育晚期这一假设在刺胞动物门和动物中都受到了质疑。但是根据我们所知，迄今为止这种质疑尚未出现在真菌中。

图1 实验材料与实验流程

硬柄小皮伞的子实体中可育组织和不育组织是由不同的细胞谱系形成

为了研究担子菌真菌中跨世代的突变传递，文章作者选择了一种能够在草地与草坪上形成蘑菇圈的真菌硬柄小皮伞作为研究材料。硬柄小皮伞的蘑菇圈是起始于一个双核菌丝，该双核菌丝由两个担孢子萌发的可亲和的单核菌丝交配形成。从这个起始点开始，菌丝体呈现放射状向外不断地扩展生长，在生长过程中不断积累突变。作者之前对该菌株进行了全基因组测序，以该基因组作为参考基因组，可以利用子实体组织的全基因组重测序对菌丝积累的突变进行研究。通过比较蘑菇圈不同区域的子实体组织的突变，并且假设所有的共享的突变是该个体祖先的变异，这样就可以推测出来子实体之间的差异是由新产生的突变所导致的。作者在2016年到2023年的蘑菇生长季节，在瑞典的乌普萨拉的一个蘑菇圈中采集了不同部位的蘑菇子实体（ring 43），此外在2023年还采集了另外一处的蘑菇样本（ring 06）。作者收集了担孢子和子实体的不同部位，包括菌褶（可育部分）和剩余的菌盖以及菌柄（不育组织），随后分别从混合孢子样品和各个组织中提取DNA，最终一共在7年间获得了来自于59个子实体的142个孢子与组织样本的数据集（图1，数据集S1）。

在完成了测序、变异识别和严格的变异筛选之后，一共鉴定出来了230个新的突变。在分析子实体内突变的空间分布的时候，可以发现孢子与菌褶之间共享突变。这一结果非常正常，因为孢子是由菌褶上面的担子母细胞产生的。然而，子实体其他的不育组织部分的突变模式则表现出来明显的差异。在部分子实体样本中，作者对组织进行了更精细的区分，结果发现，可育部分与不育部分的突变模式始终存在差异。蘑菇起源于菌丝的聚集形成的扭结，随后扭结的菌丝发育为原基，并最终形成成熟的子实体。通过对担子菌门中鬼伞属真菌的研究发现，在原基发育过程中，不同组织的分化已经能够区别开来。鉴于作者的研究结果，形成不同组织的细胞或者细胞核很可能在蘑菇发育的早期阶段就已经分离了，展示了一种发育预先决定的机制。在本研究的数据中，尽管可育组织和不育组织的总体差异始终保持一致，但是仍有一些在某类组织中高频出现的突变，以低频的形式在另一类组织中出现。这一现象有可能是技术原因导致的，比如说在解剖的过程中组织没有完全的分离，或者由于散落的孢子附着在菌柄外表面所导致的。本研究中，数据采集了两轮，在第二轮采集过程中（data S1），在组织分离过程中采取了额外的防护措施，以最大限度的减少交叉污染。第二轮采集的数据分析显示，相反基因型出现的频率要小于第一轮数据，这表明了这种信号的产生主要是由于少量组织交叉污染所引起的。当然也有可能是部分菌褶部分的组织浸入整合到了菌柄中，反之亦然，菌褶中也有可能出现少量菌柄的组织。目前，我们还无法排除任何一种假设。然而，即使低频突变能够从生物学角度进行解释，以可育和不可与组织之间大尺度的差异仍然十分明显。通过设定等位基因比例的阈值为0.2，可以一致且明确地判断突变在某类组织中存在或缺失。

图2 小皮伞的可育组织与不育组织中新生突变呈现不同的分布模式

生殖系在双核体早期发育过程中确立，并在多年生长过程中得以维持

生殖细胞系的分离时间对生物体的发育与进化具有极其重要的意义。通过比较不同蘑菇之间变异的分布情况，研究者能够间接的推断两个种系分化已经持续多长时间。结果显示，不同子实体的可育组织和不育组织之间在变异类型上始终表现出一致性的差异，不同个体的菌褶共享相同的一组突变，而菌柄者共享另一组不同的突变。这一模式在空间和时间上都具有一致性，空间上，彼此靠近的子实体在遗传上面更为相似，而距离较远的子实体则差异更大。时间上，2016年采集的蘑菇与随后几年采集的蘑菇都共享部分突变（图3）。值得注意的是，在06号蘑菇圈（ring 06）中，所有的菌柄中都检测到了同一个突变，而该突变在所有的菌褶样品中均未出现。由于这些子实体采集自菌环相对的两侧，这一结果表明，这两类的基因型的分化一定出现在菌丝体早期生长阶段。这一现象（变异模式）的另一种可能的解释是，存在外源性的遗传元件（例如质粒、附属染色体或外来生物）自私地引导某些菌丝形成孢子。然而，研究中并未发现此类的DNA。因此我们推测，硬柄小皮伞已经进化出一种内在机制，在双核菌丝建立时或其后不久就实现了生殖细胞系与体细胞系的分离。因此，在可育组织中检测到的突变可以视为生殖细胞系突变，而在不育组织中检测到的突变则属于体细胞突变。

为了探究硬柄小皮伞菌丝体中生殖系和体细胞细胞谱系的物理结构，作者分析了蘑菇圈中新生突变的分布情况。作者发现基于生殖细胞系和体细胞系分别构建的系统发育树，由于突变数量较少，各自均包含若干未解析的分支，但是两者并未显示出不一致的分裂现象（图S4）。尽管生殖细胞系与体细胞系的准确的组织形式仍然需要进一步研究，本研究的结果支持的模型显示：在菌丝生长过程中两种细胞谱系彼此紧密关联，可能是以共存于一个菌丝内的细胞核的形式存在，或者在以土壤中紧密并行生长的独立菌丝的形式存在。

图3 生殖系与体细胞在时间和空间上的持续分离

生殖细胞具有遗传上的一致性，而体细胞组织者呈现镶嵌基因型

与大部分的蘑菇一致，硬柄小皮伞在生活史的大部分时期都是以双核阶段为主。在这个阶段中，两个遗传存在差异的细胞核共存于一个菌丝空间内（图1）。这种细胞核的组织方式类似于二倍体，因此在进行基因测序的时候，两个细胞核之间多态性通常表现为0.5的等位基因比例。

对于在每个蘑菇圈中所有样品中普遍存在、并被认为来自两个亲本的变异，这种模式十分明显（图4A）。在菌褶中，观察到的多态性的分布频率模式也是分布在0.5左右，但是出现了一个向低频方向延伸的尾部，这与前面检测到的菌褶中存在少量其他基因型的结果一致。然而，在菌柄中检测到的很多突变频率低于0.5（图4A和图S5）。为了控制通过全基因组测序（WGS）读取结果确定新突变频率时可能产生的不准确性，我们使用数字PCR（digital PCR）对两处突变的频率进行了定量测定。该检测结果与WGS测得的频率基本一致，误差在5%以内（图S6）。这一模式可以解释为：每个蘑菇的可育组织是由单一的生殖系基因型的细胞构成的，但是不育组织是由不同基因型的细胞（核）所分化形成的。

图4 生殖细胞系和体细胞系中突变积累速率不同

生殖细胞系中积累的突变少于体细胞系

作者预测生殖细胞系中的基因组保持了完整性，与该预测一致，分析发现生殖细胞系中的新突变的数量少于体细胞系（分别为55个和175个），这表明了生殖细胞系的突变率较低。为了在一定的时间范围内对突变积累的数量进行比较，作者仅选取了2023年的样本，并仅仅保留了频率高于0.4的变异。利用筛选后的变异构建了系统发育树（图S7和表S1），结果显示，每个子实体中的平均突变数量在体细胞系细胞中为4.6个，在生殖细胞系细胞中为2.1个（图4C），两者相差了2.2倍，并且差异具有显著性（P <0.01， Welch双样本t检验）。编码区的突变可能在不同的细胞系中可能会存在基于功能的纯化选择，因此作者进一步分析了“非编码区”的突变率，结果跟整体的突变率一致，体细胞系中平均突变数量为2.2个，生殖细胞系中平均突变数量仅为1.2个，两者相差1.8倍且具有显著性差异（p < 0.05）。通过多年的对蘑菇圈的连续的测量，作者估算出ring 43最开始建立于2006年，ring 06最开始建立于2010年（表S2）。根据以上信息，作者估算出ring 43号蘑菇圈的突变积累速度为：体细胞系是0.27个突变/子实体/年，生殖细胞系为0.17个突变/子实体/年。ring 06号蘑菇圈的突变积累速度为：体细胞系是0.37个突变/子实体/年，生殖细胞系为0.13个突变/子实体/年。

如果硬柄小皮伞中的生殖细胞系的确立是为了抵消生长过程中突变积累造成的有害影响，那么生殖细胞系和体细胞系之间的突变积累频率的差异必须要足够大，并且能够承受减数分裂期间发生的突变。也就是说，如果减数分裂引入了高数量的突变，那么这两个细胞谱系之间的相对差异将不会那么明显，从而这就不可能成为生殖细胞系确立的驱动力。作者先前从担孢子培养物中生成的测序数据可以估算出，减数分裂突变率最高是0.26个突变/孢子/每次减数分裂。因此，在假设体细胞也将进入减数分裂，调整后的体细胞系和生殖细胞系的突变数量为4.9个和2.4个（差异为2倍）。由此可见，即使将减数分裂产生的突变也纳入分析中，生殖细胞系突变率要比体细胞系低，而且趋势是一致的。

我们从突变在基因组中的分布，碱基替换率类型，三核苷酸背景（图S8、S9），以及潜在的适应度效应等方面对生殖细胞系和体细胞突变进行了特征分析。整体来说，差别很小，这表明了在两种细胞谱系中造成突变的因素是类似的。但是由于生殖细胞系的突变率本身就很低，因此这导致了可以进行的分析的突变样本量很小，从而难以检测两种细胞系之间的差异。

讨论

本研究的实验证明了在一个蘑菇中存在生殖细胞系发育早期确立的现象。动物中，生殖细胞系的形成有的是通过母系遗传决定因子来定义的（预成论，preformation），有的是通过诱导生殖细胞系形成的特定因子的表达来实现的（后成论，epigenesis）。硬柄小皮伞和很多真菌一样，属于同配生殖类型，因此其生殖细胞系不太可能是通过预成论方式被定义。尽管作者只能够对硬柄小皮伞的生殖系定义的分子机制进行推测，但是更可能的情况是，其形成的过程类似于“后成论”，也就是通过表观遗传重编程与特性因子表达之间的相互作用来诱导生殖系与体细胞系的区分。未来的研究，例如显微观察和生命周期不同阶段对组织表观基因组和转录组进行比较分析，将有助于揭示硬柄小皮伞中生殖系与体细胞系的空间分布及其分化机制。

其中一个假设认为生殖细胞确立的优势是能够保护其免受环境因素的影响，从而降低突变率。与该假设一致，本研究的结果表明硬柄小皮伞中生殖细胞系的突变少于体细胞系，这一规律考虑了体细胞组织中遗传嵌套和减数分裂对于突变的影响之后仍然相符。此前，作者观察到了硬柄小皮伞中体细胞突变积累率较低，生殖细胞系中突变积累的频率更低。在本研究中，作者根据不同时间积累的突变数量推测出了突变率，对于观察到的差异可能存在很多种解释。在动物中，多种因素的组合导致了生殖细胞系中的突变频率低于体细胞系，包括较低的细胞核分裂速度、对外部致突变因子的保护、转录模式的差异以及DNA修复机制的活性增加等。以上的因素也可能在硬柄小皮伞中适用。这种差异也有可能是因为选择作用清除掉了一部分突变。因为本研究过程中突变的数量较低，因此作者没有看到选择信号，无法显现出任何明显的模式。生殖系与体细胞之间相对突变率的差异在排除编码区突变后仍然显著，因此本研究数据能够支持生殖系的突变率较低这一结论。本研究中观察到的突变率的差异为2倍，而在人类和小鼠中观察到的差异约为10倍。因此对于这种突变率的差异是否足够大能够为真菌自身提供益处，或者有其他的益处如驱动了生殖系确立的进化，这一点仍然是值得怀疑的。

生殖系在发育早期确立是有益的这一假设应该会使得该现象在多细胞谱系中构成进化压力。至今仍然没有在真菌中发现这一现象的原因可能是缺乏可以操作的研究系统，或者这种现象在真菌中并不是普遍存在的。真菌中存在很大的个体，例如一种蜜环菌Armillaria bulbosa可能生活了长达1500年，覆盖了超过15公顷的土地，但是也有一些真菌完成整个生活史只需要几个周的时间。作者认为在前面一种类群的真菌中降低突变频率驱动的进化选择压力应该是最大的。此外，正如Buss等人所讨论的，可以假设某些类型的生活史以及发育特征是促使生殖系隔离进化的必要条件。很多真菌是构件生物，这对生殖系统隔离的进化施加了限制，因为每个模块中必须要存在一个全能细胞。基于上面的两个假设，作者推测生殖细胞隔离主要会发生在那些寿命较长而且通过有性生殖产生孢子繁殖的真菌中进化，例如硬柄小皮伞。在很多方面，硬柄小皮伞的生活史会让人联想到两侧对称动物：两者一个主导的、通常较长的生长时期，每个细胞有两份基因组，通过减数分裂后产生的单倍体进行繁殖，并且没有或者具有有限的无性繁殖。这种生活史真菌在蘑菇中很常见，因此如果生殖细胞系的确立广泛存在于蘑菇中，也不足为奇。