麦角硫因（Egt），即2-巯基-L-组氨酸三甲基甘氨酸，是一种具有抗氧化特性的膳食衍生氨基酸。它在某些食物中含量特别高，包括部分蘑菇、谷物、黑豆、红豆、红肉以及肝脏和肾脏。体外研究、动物模型乃至临床研究均发现，Egt具有多种特性，如心脏保护和抗糖尿病作用等，因此与降低死亡率及心血管疾病风险相关。Egt对心血管疾病和慢性炎症的细胞保护作用是通过调节SIRT1和SIRT6实现的。其他证据表明，Egt可靶向线粒体，并能抑制氧化应激状态下过量产生的线粒体特异性活性氧（ROS）。事实上，负责Egt在人体组织中摄取和积累的有机阳离子转运体新亚型1（OCTN1）在一些可能易受氧化应激影响的细胞（如血细胞、骨髓、眼组织和脑组织）中高表达。预计在以脂肪酸代谢改变为特征的癌症（包括结直肠癌（CRC））中，血浆或细胞膜中的肉碱转运体表达和/或活性会发生变化。实际上，CRC细胞会表达OCTN1和OCTN2转运蛋白。OCTN1与散发性CRC的早期阶段相关，其多态性L503F被用作疾病恶性进展的生物标志物。此外，OCTN2基因rs27437多态性可通过下调OCTN2的表达，与结直肠癌发病风险增加相关。

本研究选择具有不同特性的结直肠癌细胞LoVo、HT-29和SW620细胞进行实验，其中LoVo和SW620相比HT-29更具高转移性，而HT-29细胞则比其他结直肠癌细胞更具黏附性。使用与CRC细胞系相同的剂量和暴露时间处理正常CCD 841 CoN细胞未见不良影响，表明Egt对非癌细胞无细胞毒性。结果表明，Egt（2 mM）处理72小时可导致细胞内、细胞外及线粒体水平的活性氧（ROS）积累，破坏线粒体膜电位（MMP），并通过上调TNF-α、IL-6和NF-κB蛋白表达水平，影响CRC肿瘤微环境。尽管通过HPLC和LC-MS技术测定二聚体产物的形成，才能获得细胞外和细胞内单电子氧化剂生成的证据，但本研究中对氧化产物的整体分析，旨在全面评估细胞外、细胞内及线粒体中氧化剂的生成情况，提示Egt在结直肠癌细胞中具有促氧化作用。Egt诱导的促氧化和促炎效应伴随着SIRT3蛋白含量的增加。Egt在处理72小时后以剂量依赖性方式对CRC细胞表现出细胞毒性和诱导凋亡的作用。本研究首次证实了麦角硫因Egt对结直肠癌（CRC）细胞具有体外抗癌活性。

图1. Egt在结直肠癌细胞中介导作用的示意图。SIRT3沉默可逆转Egt诱导的坏死性凋亡，这表明线粒体去乙酰化酶在抗增殖和细胞毒性结果中发挥了重要作用。

在结直肠癌中，SIRT3是一个具有致癌和肿瘤抑制作用的治疗靶点。SIRT3在结直肠癌中的肿瘤抑制作用在体外和体内使用SIRT3敲除小鼠中得到了证明，与野生型小鼠相比，SIRT3敲除小鼠的肠息肉数量和结肠增殖的严重程度增加，同时caspase-3活化减少，从而证实了SIRT3在肠道炎症和结直肠癌发展中的肿瘤抑制作用。

与肿瘤相关的炎症是CRC的一个关键特征，因为肿瘤微环境固有的炎症介质在免疫和癌细胞之间存在交互作用。本研究的数据提供了结直肠癌中炎症诱导的细胞死亡的新知识，并揭示了Egt治疗下发生的特定细胞死亡机制。结果表明Egt的抗肿瘤作用是通过与SIRT3/MLKL通路相关的程序性坏死机制实现的。IP实验表明，MLKL和SIRT3之间的相互作用在Egt处理过程中增强。有趣的是，通过小干扰RNA沉默SIRT3，可以拮抗Egt对MLKL和RIP3蛋白表达水平以及程序性坏死活化的作用，提示这一机制至少部分是由SIRT3直接介导的（图1）。在本研究中，Egt诱导的程序性坏死和细胞毒性是由ROS的积累以及RIP1-RIP3-MLKL的激活介导的。抗氧化剂NAC阻断了细胞活力的抑制，RIP1的特异性抑制剂NEC-1抑制了PI阳性CRC细胞的数量。随着RIP1/RIP3/MLKL信号通路的激活，Egt下调了cIAP1/2蛋白水平，而cIAP1/2蛋白是通过结合和抑制效应蛋白caspase-9和- 3/-7发挥作用的抗凋亡蛋白，并且下调USP22，USP22是所谓的11基因“死于癌症”表达标签中的一员，与结直肠癌的远处转移、更差的预后和较差的患者生存率相关。Egt还能有效诱导肿瘤抑制蛋白CYLD的表达，CYLD蛋白的下调与多癌和CRC的发展相关。CYLD对组织稳态贡献的一个重要方面是其通过凋亡和坏死性凋亡调节程序性细胞死亡的能力。事实上，CYLD已被确定为坏死性凋亡的重要介质，这依赖于其去泛素化RIP1的能力，并促进RIP1和RIP3的磷酸化。高水平的ROS通过增加RIP1和RIP3水平及其相互结合，介导程序性坏死细胞死亡，促进坏死体形成。因此，与质膜连接的RIP3促进MLKL的磷酸化，诱导p-MLKL的寡聚化，从而诱导质膜破裂和程序性坏死。

图2. Egt抑制CRC细胞活力。将不同浓度Egt（0、0.5、1、1.5、2、2.5和3 mM）作用于(A) HT-29、(B) SW620和(C) LoVo细胞不同时间（24、48和72 h），检测细胞活力。(D) HT-29, (E) SW620和(F) LoVo细胞用2 mM NAC预处理1小时，然后暴露于逐渐增加的Egt浓度到72小时，使用细胞计数试剂盒-8测定活力（Donjindo Molecular Technologies）。对照组细胞（0 mM）在含相应体积HBSS-10 mM Hepes的培养基中生长。数值代表n = 4个独立实验的平均值±SD，结果以对照的百分比表示。*P < 0.05 vs. 0 mM；‡P < 0.01 vs. 0 mM；§P < 0.001 vs. 0 mM。

图3. Egt诱导CRC细胞死亡。在（A-E） SW620, (F-J) HT-29和（K-O） LoVo细胞中，膜联蛋白V-FITC和碘化丙啶（PI）染色和剪切印迹以及procaspase-8的相对免疫印迹分析的代表性点图和分析。在Egt（2 mM）孵育72 h前，用1、1.5和2mM Egt处理CRC细胞或用50μm的NEC1预处理1 h。对照组细胞（0 mM）在含相应体积HBSS-10 mM Hepes的培养基中生长。通过流式细胞术评估细胞活力/死亡，获得至少20 000个事件。左下象限：活细胞；左上象限：坏死细胞；右下象限：早期凋亡细胞；右上象限：晚期凋亡细胞。通道1 = 0 mM；通道2=1 mM；通道3=1.5 mM；通道4=2 mM；M =重量标记（G266, Applied Biological Materials Inc.）以α-微管蛋白或GAPDH为内参归一化后，用IMAGEJ软件计算蛋白表达，结果以任意单位（AU）表示。数据以n = 4个独立实验的平均值±标准差表示。*P < 0.05 vs. 0 mM；‡P < 0.01 vs. 0 mM；§P < 0.001 vs. 0 mM。

尽管Egt的杀伤机制尚不完全清楚，但Egt的促氧化和抗癌作用涉及SIRT3蛋白的上调。虽然此前已有报道表明SIRT3可保护细胞免于死亡，但最近的研究发现，SIRT3的过度表达会通过调控突变型p53的泛素化，导致结直肠癌（CRC）中的代谢重编程，并触发细胞死亡，同时在小细胞肺癌中激活坏死性凋亡。然而，仍需进一步研究过表达SIRT3的CRC细胞，以明确SIRT3是否是Egt诱导的坏死性凋亡的关键介导因子。此外，进一步的研究对于深入理解其分子机制，以及为Egt在CRC中的抗癌特性提供体内证据也至关重要。

原文发表于：FEBS Letters 596 (2022) 1313-1329  https://doi.org/10.1002/1873-3468.14310