猪胃黏液包被磁珠从冷冻浆果中提取诺如病毒的效果研究

　　人类诺如病毒(NoV)是全世界食源性胃肠炎的主要原因。由于NoV的感染剂量较低，需要采用敏感的方法来检测和表征在受污染食品中发现的少量病毒颗粒。ISO 15216方法是国际公认的用于检测高风险食品中食源性病毒的方法，该方法基于病毒沉淀，然后通过RT-PCR提取RNA并鉴定病毒基因组。虽然ISO 15216方法是有效的，但它耗时且繁琐，不能判定病毒的传染性，并且对RT-PCR抑制剂比较敏感。

　　目前已有关于猪胃粘蛋白偶联磁珠(PGM-MB)捕获NoV的研究，该方法依赖于病毒衣壳的完整性能够与PGM结合。PGM含有多种作为NoV受体的组织血型抗原(HBGAs)。因此，PGM-MB方法可以从复杂的食物基质中提取具有完整病毒衣壳的NoV。经捕获的完整病毒可以通过热休克释放病毒基因组。

　　为此，本篇介绍了一项比较ISO 15216方法和PGM-MB方法对冷冻覆盆子中NoV的分离和定量的研究。实验结果表明，PGM-MB方法在树莓中提取鼠诺如病毒(MNV)和NoV GII.4的效率等于或优于ISO 15216方法，而PGM-MB方法的步骤更少，周转时间更短。此外，PGM-MB方法在RT-PCR分析之前更有效地去除抑制剂。

　　图1 A) PGM-MB和B) ISO-15216操作流程图。A) 9个样品的整个过程可在7.5 h内完成，其中5 h为实际工作台时间，其余为孵育时间。B) 9个样品的整个过程大约需要36小时，包括10.5小时的实际工作台时间，其余时间为孵育时间和过夜中断时间。

　　最低检出限数据表明，PGM-MB和ISO-15216方法的LOD是相同的，而PGM-MB 1mL方案的LOD大约高出0.3 log。

　　图2 用MNV测定人工污染冻树莓中每种方法的检出限(LOD)。每个数据点是3次重复的平均值，误差条表示标准差。白色(空心)标记表示至少有1个重复为阴性(部分阳性)的数据点。回归线延伸到第一个分数正点。认为低于检测限的数据点被圈出。

　　三种方法的回收率均在1%以上，都是可接受的最低回收率，但PGM- MB-1mL方案在所有测试浓度下的平均回收率均高于其他两种方法。仅在一种浓度(6.31 log gc/25 g)下，PGM- MB 40-mL方案与ISO 15216之间的回收率差异具有统计学意义(图3)。

　　图3 计算高于检测限范围的MNV回收率。回收率(%):(获得的基因组拷贝数)/(接种的基因组拷贝数)× 100.数据为3个重复的平均值。误差条表示标准差。**P < 0.001.*P < 0.05.经非配对t检验计算。

　　如表1所示，ISO-15216提取法的PCR抑制量平均比PGM-MB法高约7倍。

　　表1 抑制分析。通过未稀释和1:10稀释的RNA之间检测到的基因组拷贝增加的百分比来计算抑制作用。每个数据点是3个独立重复的平均值。

　　PGM-MB方法的结果从2.65 log gc/25g开始。当这些值与MNV的结果进行比较时，PGM-MB方法的LOD似乎比NoV的LOD低约1 log。

　　图4 使用NoV GII.4确定每种方法的检出限。每个数据点是3个独立实验的平均值，误差条表示标准差。空心标记表示至少有1个重复为阴性(部分阳性)的数据点，因此非常接近检测极限。回归线延伸到第一个分数正点。

　　在较高的病毒浓度(5.65-6.65 log gc/25 g)下，ISO 15216:2017的回收率显著较高，但在较低的病毒浓度下，这两种方法的回收率在统计学上相等(3.35-4.65 log gc/25 g)(图5)。

　　图5 计算高于检测限范围的NoV GII.4回收率。回收率(%):(获得的基因组拷贝数)/(接种的基因组拷贝数)× 100.数据为3个重复的平均值。误差条表示标准差。**P < 0.001.*P < 0.05.经非配对t检验计算。

　　参考文献：

　　Plante D, Barrera J A B, Lord M, et al. Examining the efficiency of porcine gastric mucin-coated magnetic beads in extraction of noroviruses from frozen berries[J]. Food Microbiology, 2024. 120: 104461.