人源诺如病毒样颗粒在各种环境条件下的生物和物理化学表征

人源诺如病毒(HuNoV)是胃肠炎的主要病原体，导致全球高达80%的非细菌性胃肠炎病例。HuNoV基因组是一种正义RNA，由大约7500 bp组成。基因组分为三个开放阅读框(ORF)：ORF1编码200 kDa的非结构多蛋白，而ORF2和ORF3分别编码主要(VP1)和次要(VP2)衣壳蛋白。

HuNoV可分为10个基因组(GI–GX)，这些基因组根据VP1衣壳氨基酸序列细分为多种基因型。GII.4 HuNoV参与了大多数HuNoV疫情，自1990年代中期以来一直占主导地位。2014年和2015年在亚洲广泛传播的GII.17分离株。GII.17基因型可分为三种不同的变异，CS-E1.Kawasaki 328和Kawasaki 308.后者最为普遍。

VLP可以在不同的处理下分解然后重新组装成由60和80个VP1拷贝组成的颗粒。有研究人员指出/假设VLP的稳定性可以通过缺乏病毒基因组而改变。VLP已被用于研究VP1组装和颗粒稳定性。数据表明，VLP的稳定性与基因型有关，例如GI.1和GII.4在不同的pH、离子强度和温度条件下。研究了柠檬酸盐缓冲液对GII.10变体的影响，并表明它可以改变衣壳形态。虽然使用人肠道类肠素培养HuNoV是该领域的一项突破，但由于使用杆状病毒表达系统可以获得大量材料，VLP仍然是研究HuNoV生物学和物理化学特征的有吸引力的模型。鉴于基于HuNoV特异性VLP的疫苗的开发，对VLP的研究一如既往地相关。

VLP稳定性的研究对于更好地了解HuNoV在环境中的持久性和诺如病毒生物学具有特别的意义。最近的一项研究表明，HuNoV VLP在使用HIEs的内吞步骤中触发与天然病毒颗粒相同的细胞反应，验证了VLPs作为HuNoV替代物的使用。鉴于未来开发基于VLP的针对HuNoV的疫苗，人们对VLP的研究也重新产生了兴趣。杆状病毒表达的VLP的主要优点是重组蛋白可以大量表达。在这里，重组GII.4和GII.17杆状病毒允许生产一瓶分别相当于2和3mg/180cm²的CsCl纯化的VLP(数据未显示)，从而能够对VLP进行物理化学研究，就像在这项工作过程中进行的研究一样。在这里，提出了对来自两种常见基因型GII.4和GII.17的VLP的物理和生物学研究。

图 研究的数据摘要

在没有VP2的情况下，两种VLP在4°C下稳定至少1个月以上。据推测，VP2可以为衣壳结构带来稳定性[1]。VP2是猫杯状病毒衣壳的一部分，其编码序列对于感染性颗粒的产生至关重要。VP2在病毒粒子对接后可在衣壳中重新排列，形成孔状结构。对于鼠诺如病毒(MNV)，VP2参与诺如病毒保护性免疫，该免疫是菌株依赖性的。对于HuNoV，最初的报道表明，VP2使用杆状病毒表达系统被锁定在VP1制造的衣壳内。最近，在细胞质中也观察到VP2.尽管文献普遍表明VP2是衣壳的一部分，但我们的数据表明，杆状病毒表达的VLP可以在没有VP2的情况下长期稳定，其原生体的数量和精确位置尚未确定HuNoV。

还确定了VLP与HBGA的结合能力与缓冲液、pH值、离子强度和温度的关系。与离子强度不同，pH值和温度是VLPs结构和生物学功能的重要参数。当温度升高时，我们没有观察到VLP的瞬态变化。60°C的温度诱导VLP突然且不可逆变性。pH值的影响略有不同。酸性和碱性pH的影响再次是不可逆的。然而，pH9.6不影响VLP结构，而HBGA结合能力大幅降低。VLP缺少基因组RNA，但这仍然可能无法解释为什么VLP在酸性pH值下不稳定。有人可能想知道HuNoV颗粒在禁食状态下如何抵抗胃酸。在进食状态下，病毒粒子可能会被吸附到胃内容物中的食物颗粒中，对酸性较低的胃液产生抵抗力，并毫发无损地进入小肠。基于HIE的研究将有助于明确评估HuNoV的存活率和传染性，如先前所述的杀病毒化合物。未来任何基于VLP的口服疫苗也存在类似的挑战。后者将需要特殊的配方，以将VLP保存在胃中，并确保它们在小肠中延迟释放。应该注意的是，这种策略已被用于Vaxart HuNoV疫苗，如前所述，将表达HuNoV VP1的工程化腺病毒封装在口服片剂中。

研究的主要局限性是使用杆状病毒表达的VLP而不是天然颗粒。合成颗粒可能无法完全模拟存在基因组RNA的天然HuNoV颗粒，因为病毒RNA也可以参与颗粒稳定性。此外，即使VLP通过CsCl梯度纯化，VLP制剂也是VP1的混合物180和VP160-等效的VLP。需要进一步的研究来确定两种类型的VLP是否具有相同的物理和化学性质。评估异质性VLP制剂是否适合疫苗制剂也很重要。文献和我们的数据表明，VP2在衣壳稳定性中的作用尚不清楚，它在免疫反应中的参与也尚不清楚。鉴于上述所有数据，VLP稳定性的研究因此具有高度相关性，因为目前正在进行基于VLP的HuNoV疫苗研究，其中主要GII.4 VLP可能包含在疫苗配方中。

参考文献：

[1] Abou-Hamad N., Estienney M., Chassagnon R., et al. Biological and physico-chemical characterization of human norovirus-like particles under various environmental conditions [J]. Colloids Surf B Biointerfaces, 2023. 231: 113545