关于化妆品中蜡样芽孢杆菌群活细胞的qPCR检测

　　快速分子技术，如qPCR，可以检测样品中目标DNA的存在，包括死细胞和活细胞。DNA间染料，如丙溴单偶氮(Propidium Monoazide, PMAxx)，能够将PCR扩增限制在活性微生物细胞中。

　　本文利用16S rRNA和磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C(PLC)基因特异性序列与PMAxx结合，开发了用于检测蜡样芽孢杆菌(B. cereus)的单通道和多通道实时(qPCR)检测方法。在B. cereus 3A的纯培养中，16S rRNA的检测限为~ 1对数CFU/ml，PLC检测限为3对数CFU/ml。通过使用212株菌株评估了qPCR检测方法的包容性和排他性，其中包括143株B. cereus成员，38株非B. cereus和31株非芽孢杆菌物种;16S rRNA的包容率为100%，PLC目标的包容率为97.9%;16S rRNA的排他率为100%，PLC目标的排他率为98.6%。然后，使用这些qPCR检测方法评估了商业化妆品样品：一组液体面部爽肤水(N= 3)，人工污染了B. cereus 3A，以及一组之前确定为B. cereus污染的粉状化妆品(N= 8)。对于某些样品，同时通过qPCR分析，有和无PMAxx处理。所有测试部分同时在BACARA平板上划线，以确认芽孢杆菌的活性细胞，根据培养方法。发现单通道和多通道qPCR检测方法的敏感性没有差异(P> 0.05)。在未能从平板上恢复B. cereus的接种样品中，仍显示出DNA目标的扩增。

　　然而，在经过PMAxx处理的样品中，扩增明显延迟(P< 0.0001)，16S rRNA和PLC的CT值差异分别为7.82和7.22.同样，在从平板上恢复B. cereus的接种样品中，扩增延迟显著(P< 0.0001)，16S rRNA和PLC的CT值差异分别为2.96和2.36.证明了样品中死细胞的存在。所有的qPCR结果与在BACARA平板上的检测结果相关(kappa，k = 0.99)，与PCR检测中PMAxx的存在无关。然而，PMAxx染料的扩增阈值明显高于非PMAxx染料。

　　该研究结果证实，qPCR可以用于更快速地检测化妆品中的微生物，包括B. cereus，并且可以通过使用PMAxx染料来选择性地检测活细胞。