诺如病毒采取宿主生存策略促病毒排出

  病毒模仿宿主因子以获得对宿主的选择性优势，并破坏宿主的防御策略。细胞程序性死亡是宿主对抗病毒感染的关键防御策略，许多病毒已经进化出逃避或阻止细胞程序性死亡的策略。相反，一些病毒需要细胞裂解作为病毒复制的最后一步，这些病毒可能也进化出了诱导细胞死亡的机制。作为非包膜病毒，诺如病毒被认为通过细胞裂解从感染的细胞中释放，但也有一些报道认为它会释放外泌体。然而，具体机制如何仍不清楚。

  非包膜病毒需要细胞裂解才能从感染的细胞中释放出新的病毒粒子，这表明这些病毒具有诱导细胞死亡的机制。诺如病毒就是这样一种病毒，但目前还没有已知的机制证明诺如病毒感染引发细胞死亡和溶解。该研究确定了诺如病毒诱导细胞死亡的分子机制是诺如病毒编码的NTPase NS3含有一个N端四螺旋结构束结构域，与假激酶混合谱系激酶结构域(MLKL)的膜破坏结构域同源。NS3具有线粒体定位信号，通过靶向线粒体诱导细胞死亡。全长NS3蛋白及蛋白N端结合渗透线粒体膜，引起线粒体功能障碍。NS3的N端区域和线粒体定位基序对于小鼠的细胞死亡、病毒从细胞中排出和病毒复制都是必不可少的。这表明，诺如病毒获得了宿主MLKL样孔隙形成结构域，通过诱导线粒体功能障碍促进病毒排出。

  Ninj1(神经损伤诱导蛋白)可介导质膜破裂，研究分别用急性和持续性鼠诺如病毒(MNoV)-CW3和CR6株感染BV2小鼠小胶质细胞系的野生型和Ninj1−/−细胞。感染后，Ninj1−/−细胞肿胀，形成气泡状突出，甚至在感染后48小时仍保持这种球囊形态(图1a)。通过ATP水平测量表明，Ninj1的缺失并不能防止病毒引发的细胞死亡(图1b)。然而，Ninj1缺陷抑制了诺如病毒感染时乳酸脱氢酶(LDH)的释放，表明质膜保持完整(图1c)。为了确定病毒释放是否需要质膜破裂，我们在病毒感染后12和24小时测量感染细胞上清液中的病毒滴度。野生型和Ninj1敲除细胞产生的细胞内病毒的量一致，但Ninj1−/−细胞上清液中检测到的病毒明显减少(图1d)。因此，表明Ninj1在诺如病毒感染期间介导质膜破裂，并调节病毒从感染细胞中排出。

  图1 Ninj1介导质膜破裂促病毒排出

  为了确定病毒蛋白是否直接引发细胞死亡，研究在人胚胎肾(HEK) 293T细胞中异位表达了单个MNoV基因。发现NTPase NS3的表达，降低了细胞活力，如ATP水平(图2a)。CR6和CW3 MNoV菌株的NS3均诱导细胞死亡和LDH释放(图2b)。诺如病毒NS3是一种高度保守的非结构蛋白，具有NTPase活性，对病毒基因组合成至关重要。之前研究也表明诺如病毒NS3可能促进转染细胞的凋亡。NS3包括三个结构域：N端结构域(NTD)，核心结构域和C端结构域(CTD)。将MNoV CR6和CW3中带有N端Flag标记的全长、N端\C端在HEK 293T细胞中短暂过表达(图2c,d)，或稳定过表达(图2e,f)。发现N端结构域和全长NS3可诱导两种细胞类型的细胞死亡(图2c-f和)。此外，含有病毒解旋酶和肽酶功能的C端结构域不是细胞死亡所必需的。为了深入了解NS3相关的细胞死亡，进行了蛋白质建模和详细的序列分析。发现MNoV NS3的N端可能编码一个四螺旋束(4HB)域。而MLKL也含有4HB域，因此假设MNoV NS3的N端可能编码MLKL样蛋白。通过预测MNoV NS3残基N端氨基酸序列的二级结构，发现其包含5个α-螺旋(图2i)。为了确定MNoV NS3 N端结构域是否类似于小鼠MLKL的4HB结构域，基于小鼠MLKL蛋白的结构(PDB: 4BTF)对NS3残基25-158进行了蛋白质建模(图2h)。该分析(图2k)揭示了4HB结构域与α-螺旋重叠的序列同构。

  图2 诺如病毒NS3的N端结构域与MLKL的四螺旋束结构域具有同源性

  用免疫荧光显微镜观察NS3的亚细胞分布发现，NS3-C仅在细胞质部分检测到，NS3-N则富集在线粒体部分(图3b)。突变表达的NS3-N和NS3-FL(全长)缺乏线粒体定位基序的细胞没有显示细胞毒性(图3c)， 还观察到NS3-N和NS3-FL与模拟线粒体外膜(OMM)的脂质体(图3e)相互作用，NS3-N和NS3-FL均引起近70%脂质体渗漏(图3f)。为了提供NS3渗透线粒体膜的直接证据，研究用纯化的MNoV NS3蛋白孵育BV2细胞的线粒体。NS3-FL和NS3-N都强烈的诱导线粒体释放细胞色素C，而NS3-C则没有(图3g)

  图3 诺如病毒NS3引起线粒体功能障碍

  为了确定NS3诱导的细胞死亡是否是病毒排出所必需的，研究使用MNoV的反向遗传系统生成缺失NS3的N端区域或缺失NS3的线粒体定位基序的突变病毒。与野生型MNoV相比，突变病毒无法裂解BV2细胞(图4a-c)。尽管突变病毒的复制水平与野生型病毒相似，但它们失去了从细胞排出的能力(图4d,e)。用突变病毒感染小鼠后肠道组织和粪便中很少检测到病毒基因组(图4f-i)。

  图4 NS3引发的细胞死亡是诺如病毒排出所必需的

  该发现挑战了人们普遍的认知，即诺如病毒引发的程序性细胞死亡是一种宿主生存策略，虽然宿主细胞的程序性细胞死亡限制了许多病毒的病毒复制，但主动诱导细胞死亡促进了病毒传播。同时该研究中使细胞程序性死亡和病毒排出的策略，也可能被其他病毒使用。

  参考文献：

  Wang, G., Zhang, D., Orchard, R. C., Hancks, D. C., & Reese, T. A. (2023). Norovirus MLKL-like protein initiates cell death to induce viral egress. Nature, 616(7955), 152–158.