外源性NADH促进氨基糖苷类抗生素对迟钝爱德华氏菌的杀菌作用

由于抗生素的滥用和过度使用，全球多重耐药菌的激增对人类和动物的健康构成了相当大的风险。爱德华菌属于20世纪60年代在日本被首次报道，包括3个分类单元，其中之一是迟钝爱德华氏菌，其宿主范围广泛，可感染多种鱼类、爬行类、鸟类和哺乳动物。迟钝爱德华氏菌通常被认为是鱼类爱德华氏菌病的病原，目前已在七个大洲的25多种鱼类中检测到，此外它还被认为是一种中度人畜共患细菌，能够感染各年龄组和免疫系统受损的个体。由于疫苗研发仍处于幼年阶段，抗生素仍然是治疗迟钝爱德华氏菌引起的鱼类和人类疾病的主要手段。然而，抗生素的大量使用造成了迟钝爱德华氏菌对多种抗生素表现出先天抗性，导致抗生素治疗效果欠佳。

四环素类、大环内酯类、磺胺类、喹诺酮类和氨基糖苷类抗生素在水产养殖中被广泛使用。在氨基糖苷类抗生素中，新霉素在水产养殖业中已被广泛用于控制细菌和病毒感染，例如，新霉素对鱼类的产气单胞菌和鲤疱疹病毒2型感染有效，在治疗迟爱德华氏菌引起的感染中也同样有效，但该抗生素在水产养殖中的大量使用增加了耐药性的发展，可能会损害其有效性。

耐药菌代谢途径的改变被认为与耐药性的调控有关。多项研究证实，细菌对抗生素的敏感性可以通过调节其代谢途径而改变。有实验证明，增强细菌的脂肪酸合成可以促进耐药性的产生；单磷酸腺苷脱氨酶驱动的核苷酸代谢变化已被证明可以增强对耐受和持久性细菌的清除。有研究发现外源添加丙氨酸或葡萄糖等碳源通过促进三羧酸(TCA)循环提高了迟钝爱德华氏菌EIB202对卡那霉素的敏感性，这一现象与细胞内还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)浓度的变化密切相关。NADH是细胞能量代谢的重要产物，通常由TCA循环和糖酵解合成.一些研究表明，细菌的耐药性往往伴随着细胞内NADH浓度的降低，从而导致能量代谢状态的降低。

本研究旨在阐明外源添加NADH后迟钝爱德华氏菌ATCC15947发生的代谢变化，以及这些变化如何通过代谢组学增强新霉素对ATCC15947的杀伤力。

本研究通过直接使用作为关键代谢调节因子的外源性NADH，成功逆转了ATCC15947对多种抗生素的耐药性，NADH还可以增强多西环素和氟苯尼考对ATCC15947的杀菌活性。本研究结果表明，NADH改变了细菌的代谢组，诱导了几种代谢途径的变化，并且嘌呤代谢的激活在逆转ATCC15947对新霉素的耐药性中起着至关重要的作用。添加NADH后，参与嘌呤代谢的基因表达和酶活性，包括apt、adk表达和NDK活性均上调，这些基因和酶参与调节嘌呤代谢产生ATP，嘌呤代谢的激活可以增加细胞内ATP含量，这是增强细胞内能量代谢的重要机制。同样，NADH激活呼吸链也有助于细胞内ATP含量的增加。ATP生成的增加导致代谢速率的增加，最终导致细胞死亡。通过嘌呤代谢和呼吸链反应改善能量代谢和ATP生成对逆转ATCC15947耐药性具有重要意义。

除了嘌呤代谢外，NADH的引入使呼吸链过度激活，导致质子动力势(PMF)的变化，引起细菌中氧化-抗氧化系统的失衡。PMF包括ΔpH和ΔΨ，有助于氨基糖苷类抗生素的摄取。NADH诱导的ΔpH变化导致PMF增加，从而提高细胞内新霉素的水平，最终导致细菌死亡。有研究发现，L-谷氨酰胺通过破坏ΔpH和增加细胞膜通透性来增强庆大霉素摄取，增加氨基糖苷类抗生素对MRSA的抗菌作用。氧化-抗氧化系统的破坏不仅提高了ROS水平，而且改变了NAD⁺/NADH和NADP⁺/NADPH的比值。此外，细胞内NADH水平升高引起的ROS积累增强了氨基糖苷类抗生素的杀菌作用。与革兰氏阴性菌的β-内酰胺类抗生素耐药机制中水解酶破坏抗生素类似，ATCC15947中存在一种能够水解氨基糖苷类抗生素的蛋白。氨基糖苷类抗生素由氨基糖苷类修饰酶进行化学修饰，包括APHs、ANTs和AACs。其中，本研究仅在ATCC15947细胞中表达AACs。值得注意的是，通过分子对接，NADH和AACs之间可能存在潜在的相互作用，这可能导致AACs活性的抑制。本研究的一个局限性是无法确定嘌呤代谢或呼吸链是否在NADH处理下增强新霉素的杀菌作用中起关键作用。这种不确定性来自于嘌呤代谢和呼吸链与ROS之间的联系以及它们产生大量ATP的能力。

外源性NADH促进了四环素类和氯霉素类抗生素的杀菌效果，NADH联合新霉素对其他临床耐药菌有效，包括嗜水气单胞菌、副溶血性弧菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌。这些结果可能有助于在水产养殖和临床环境中开发有效的方法来预防和管理迟钝爱德华氏菌引起的感染和多重耐药性。

原文出处：https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/21505594.2024.2367647#abstract