PHEIGES：来自工程基因组的全细胞游离噬菌体合成和选择

噬菌体是生物技术和医学的宝贵生物储存库。由于缺乏快速设计、组装、包装基因组和选择噬菌体的方法，开发如此巨大资源的能力受到阻碍。无细胞转录-翻译(TXTL)提供了解决这一限制的实验设置。该研究描述了噬菌体工程的体外基因表达和选择(PHEIGES)利用T7噬菌体基因组和大肠杆菌TXTL。噬菌体基因组由PCR扩增的片段在体外组装，并直接在批量TXTL反应中表达，在一天内产生高达10¹¹ PFU/ml的工程噬菌体。并且该研究进一步证明了大量TXTL中噬菌体组装的显著基因型-表型连锁。这使得从包含尾纤维突变文库的噬菌体基因组中快速选择具有改变的粗脂多糖特异性的噬菌体成为可能。同时，本文也通过将这些具有荧光基因整合和10%基因组长度缩减的突变体进行一锅组装，建立了PHEIGES的可扩展性。

PHEIGES技术路线如下：1.噬菌体基因组通过PCR扩增成具有重叠序列的DNA片段；2.PCR产物纯化后用3’核酸外切酶产生粘性末端，将酶热失活后在体外退火组装；3.将组装产物添加到TXTL中合成噬菌体。通过此技术，能够成功合成T7噬菌体，并且能够在T7基因组的三个不同位点插入mCherry荧光报告基因，成功创建了三种T7-mCherry噬菌体。通过这种方法，研究者能够筛选出阳性噬菌体菌株，并通过NGS测序确认了插入位点，证明了PHEIGES在精确基因组编辑方面的具有 一定的能力。

通过PHEIGES技术也能够减小T7噬菌体基因组大小。通过删除T7噬菌体非必需的基因片段，重新组装一个新的T7噬菌体，成功创建了一个更小的T7变体（T7-mini），T7 - mini可以进行高达5 kbp的插入重组，比原始的T7噬菌体能插入更大的基因片段，它在保持感染能力的同时，提供了更多的空间用于插入新基因。

PHEIGES技术也可以扩展T7噬菌体的宿主范围，使其能够感染原本T7 WT无法感染的大肠杆菌菌株。T7噬菌体尾丝基因17是噬菌体宿主范围的主要决定因素之一，将基因T7进行诱变，构建突变文库，再通过PHEIGES技术进行体外合成T7噬菌体突变体。通过这种方式，能够探索噬菌体的感染机制，并为治疗和生物技术应用培育出更有效的噬菌体。

通过实验也能够找到PHEIGES的基因型-表型（g/P）联系的证据，这对于噬菌体展示技术至关重要。研究者通过实验证明了在没有物理分隔的情况下，噬菌体的基因型和表型之间存在显著的耦合，这为噬菌体的应用提供了新的视角。

总之，本文描述了PHEIGES技术，这为噬菌体工程提供了一种快速、低成本的方法，此技术能在任何允许位点上同时进行基因缺失和插入，突变率可以随意调整，促进多重噬菌体基因组工程，能够探索基因组基因集产物编码的活性也可以快速构建和识别特定功能的噬菌体突变体，能够对噬菌体包装和噬菌体-宿主相互作用进行基本的生物学探测，并且可以迭代地快速进行允许噬菌体工程和选择，而不需要细胞扩增或其他基因型-表型偶联的合成手段，如细胞大小的乳化液滴。且预计PHEIGES可以应用于任何被证明是无细胞合成的噬菌体，如非模型和专性裂解噬菌体。因为发现除了T7和T438外，噬菌体T6和VPAE166以及沙门氏菌噬菌体FelixO167和S16都可以用本研究的TXTL系统从它们纯化的基因组中无细胞合成。这项工作不仅为噬菌体工程提供了一个快速、低成本和易于操作的新方法，还为未来在生物技术和医学领域中开发新型噬菌体疗法和疫苗提供了可能。