Nature Protocols：新一代噬菌体载体，运输核酸药物！

核酸递送技术是基因治疗和核酸药物开发中的关键环节，它涉及到将核酸分子（如DNA、RNA）有效地传递到细胞内，以实现治疗目的。核酸分子由于其带负电的特性，难以穿过细胞膜，因此需要特殊的递送系统来保护它们免受降解，并促进其在体内的传递和细胞内的吸收。

核酸递送系统可以分为非病毒性和病毒性两大类。非病毒性递送系统，如脂质纳米颗粒（LNPs）、聚合物纳米颗粒和无机纳米颗粒等，因其较低的免疫原性和较高的生物相容性而受到广泛关注。虽然病毒性载体可能会引起免疫反应和安全性问题，但是他的高转染效率吸引了众多研究人员的关注。噬菌体是一类感染细菌、真菌、藻类、放线菌或螺旋体等微生物的病毒，它们可以作为基因工程中的载体，用于传递外源DNA分子进入宿主细胞并进行复制和表达。噬菌体载体可以进一步分为插入型载体和替换型载体。插入型载体通常只含有一个克隆位点，允许外源DNA片段插入；而替换型载体则具有成对的克隆位点，允许外源DNA片段替换载体的一部分。这些载体的设计使得它们能够用于不同的基因克隆和表达实验。与传统的非病毒性递送系统相比，噬菌体递送系统具有一系列优势，尤其在安全性方面表现出其独特的潜力。这是因为它们由蛋白质和核酸组成，噬菌体在人体内的使用不太可能引起免疫反应或其他不良反应。此外，噬菌体递送系统的可修饰性也受到广大研究人员的喜爱。噬菌体递送系统可以通过基因工程进行定制，以增强其安全性和有效性。帝国理工学院Amin Hajitou团队 在《Nature Protocols》上发表了一篇名为“Construction and utilization of a new generation of bacteriophage-based particles, or TPA, for guided systemic delivery of nucleic acids to tumors”的文章，介绍了一种创新的基因治疗策略，利用新型转形态噬菌体/腺相关病毒（TPA）载体，通过噬菌体外壳蛋白包装人类腺相关病毒DNA，实现对肿瘤组织的靶向输送核酸药物。

图1 AAVP和TPA颗粒及其相应DNA构建体/基因组的示意图

在图中，AAVP颗粒被描绘为较大的病毒颗粒，其基因组中包含了噬菌体的结构基因。而TPA颗粒则相对较小，其内部仅包含由AAV2 ITRs包围的转基因盒，没有包含噬菌体的结构基因。RGD4C靶向肽在两种颗粒表面，这种肽有助于颗粒与肿瘤细胞表面的特定受体结合。此外，图中还表示了f1复制起点和ITRs，这些都是构建这些病毒载体时关键的遗传元素。

图2 TPA颗粒的制备、生产和功能分析

流程图的开始部分涉及TPA颗粒的基因构建和辅助噬菌体的克隆，这是生产TPA颗粒的基础。研究人员首先需要构建含有目标基因的TPA DNA，然后将其与辅助噬菌体的衣壳蛋白结合，以便在细菌宿主中生产TPA颗粒。接下来，流程图描述了体外实验的步骤，其中包括使用携带报告基因的TPA颗粒对选定的细胞系进行转导。这些报告基因可以是GFP或荧光素酶，它们帮助研究人员通过各种分子生物学技术来分析转基因的表达，如流式细胞术、荧光显微镜和qPCR等。流程图的后半部分转向体内实验，详细说明了如何将TPA颗粒通过系统性静脉注射应用于携带肿瘤的小鼠模型。研究人员需要评估TPA颗粒在体内的转导效率、生物分布、治疗效果和安全性。这通常涉及到对小鼠进行多次注射，然后通过生物发光成像、血清学分析和组织学检查等方法来评估治疗效果。

图3 使用细菌超级感染生产系统生产TPA颗粒的示意图

利用细菌超感染方法生产TPA颗粒这个过程开始于挑选一个含有TPA构建的细菌菌落，然后在适宜的条件下培养这个菌落，直到细菌达到生长的中期。接着，向培养基中引入辅助噬菌体，这种噬菌体将提供构建TPA颗粒所需的外壳蛋白。在一定的温度下孵育一定时间后，将培养基转移到新的培养基中，并在较低的温度下继续培养过夜。培养完成后，通过离心将细菌细胞从培养基中分离出来，只保留含有TPA颗粒的上清液。为了从上清液中沉淀出TPA颗粒，向其中加入聚乙二醇和氯化钠的混合溶液，这种溶液有助于增加颗粒的重量，使其沉淀。沉淀过程在低温下过夜进行，之后通过再次离心来收集沉淀物，并去除上清液中的剩余液体。收集到的TPA颗粒沉淀物需要用PBS重悬，这一步骤可能需要重复几次，以确保颗粒的充分沉淀和纯化。在重悬过程中，可能需要逐渐加入PBS，以帮助颗粒完全溶解。最后，通过过滤步骤去除任何可能残留的细菌碎片或其他杂质，得到纯净的TPA颗粒溶液。

TPA颗粒通过利用M13噬菌体的外壳蛋白来包装AAV的DNA，实现了对肿瘤组织的高效靶向输送。论文中详细描述了TPA颗粒的设计原理，包括其依赖辅助噬菌体提供衣壳蛋白的ITR包围的转基因表达盒，以及噬菌体的复制起点，使得rAAV2 DNA在细菌宿主内得以复制并被噬菌体衣壳蛋白包装。生产方法涵盖了使用细菌超感染系统、优化生产条件以及通过沉淀和过滤步骤纯化TPA颗粒的详细步骤。