开发基于细胞培养的奶制品中传染性蜱传脑炎病毒 （TBEV） 的方法

近几年在全球被不断发现有新的蜱传病毒，一般通过叮咬向人类传播病毒，但近来发现受污染的奶制是食源性传播的主要途径。为了解决奶制品中传染性蜱传脑炎病毒（TBEV）的常规检测，Catherine等人开发了一种基于细胞培养的方法来检测人工污染的生山羊奶和生山羊奶酪中的传染性 TBEV，并评估了 TBEV 感染性测定的敏感性。由于山羊奶制品通常与欧洲TBEV食源性传播有关，因此本研究使用了生山羊奶和山羊奶酪作为奶样品。

图1 DMEM、山羊奶和奶酪样本的细胞感染流程图

用 TBEV 加标生羊奶样品，以达到平¹⁰⁶到 _{^{100TCID 50/}}毫升的接种水平，对两种奶酪样品进行加标，使其 TBEV 浓度范围为 ^{9.28 × 105}至 _{^{9.28 × 101TCID 50/}}每 2.5 克。为了检测传染性 TBEV，Vero 细胞被生羊奶感染。对于奶酪样品，在匀浆和膜过滤后，用吸附在过滤器上的样品（方法 A）或从过滤器洗脱的样品（方法 B）感染 Vero 细胞（图1）。5 天后，观察到细胞病变效应（CPE），并通过在细胞上清液中检测到的基因组拷贝数/mL 的增加来证实 Vero 细胞中的 TBEV 复制。

1.TBEV下诱导CPE

在 5 dpi 下用未接种的生乳制品（牛奶和奶酪样品）处理的 Vero 细胞的显微镜观察显示，乳制品残留物对 Vero 细胞没有细胞毒性作用，并证实感染中使用的方法对细胞无害。中TBEV 感染细胞中的 CPE 由折射细胞和至少 3-4 个细胞的链表示。感染的 Vero 细胞在牛奶和奶酪样品中均表现出 CPE。（图2）

图2

2. DMEM和生羊奶中TBEV 感染性测定的敏感性

为了评估 TBEV 感染性测定的敏感性，将 DMEM 和牛奶样品加标到不同的接种水平。

表 1显示了根据接种的 TBEV 数量从加标 DMEM 和生牛奶样品中定性检测感染性 TBEV 的结果。

其中 DMEM 加标 TBEV 水平为 ¹⁰⁶到 _{10 TCID50/}毫升，CPE 在感染 DMEM 的 Vero 细胞中可见。加标 TBEV 的未稀释牛奶样品，范围为 ¹⁰⁶到 ^103TCID 公司₅₀/mL 和 10 倍稀释的加标 TBEV 牛奶样品，范围为 ¹⁰⁶到 _{^{104TCID 50/mL}} 显示可见的 CPE。

为了确认 Vero 细胞中的 TBEV 复制，使用 5 dpi 从培养上清液中提取的 RNA 进行 RT-qPCR 检测。RT-qPCR 结果显示平均值为 8.30 ± 8.10 log10基因组拷贝数/mL，证实了无论哪个水平都存在到病毒依赖性CPE。

3. 奶酪样品vero 细胞中的 TBEV 复制和感染性测定的敏感性

RT-qPCR测定的奶酪样品的 Vero 细胞中 TBEV 复制的结果如表 2。

在5dpi的Faisselle的病毒基因组滴度达到 ¹⁰⁶到 ¹⁰⁸，Tomme的病毒基因组滴度达到¹⁰⁵到 ¹⁰⁷基因拷贝数/ml。对于奶酪样品，平均值增加了 3.32 ± 1.72 log10在细胞培养上清液中的病毒基因组滴度之间，1h30 pi 和 5 dpi 之间确认了生产性病毒感染。

根据接种水平，每种方法的感染性 TBEV 检测结果显示在表 2。方法A的检测阳性率比方法B略高。对Faisselle样品而言，A和B方法都能检测到^{_{9.28 ×101 TCID50}}，但对Tomme样品而言，A和B无法测到这个水平。方法A能比B多检测2个^{_{9.28 ×103 TCID50}}水平的样本、3 个^{_{9.28 ×102 TCID50}}水平的样本。总体而言，对于接种不同水平 TBEV 的 Faisselle 和 Tomme 的所有样本，方法 A 的感染样本数量略高于方法B。阳性样本的数量随病毒接种量而异。^{_{9.28 × 10 5 TCID50}}和^{_{9.28 × 103TCID50}}水平的TBEV比其他水平的检测率高。

参考文献：Development of a cell culture-based method for detecting infectious tick-borne encephalitis virus (TBEV) in milk products