核酸检测技术在食源性病毒检测中的最新进展

导读：文章聚焦样本前处理、传统PCR技术及创新的等温扩增技术，探讨其应用于食品安全的潜力及局限性。作者总结了相关检测技术的优势和不足，为开发适合食源性病毒普适性检测方法提供了重要参考。

一、食源性病毒检测的挑战与技术进展

食源性病毒是食品安全的重要威胁，其传播途径多样，包括动物源性食物、加工污染及食品从业者的接触传播。常见病毒如诺如病毒（NoV）、甲型和戊型肝炎病毒（HAV和HEV）等，通过污染的水、贝类或蔬果引发胃肠道症状甚至死亡。传统培养方法检测病毒较慢，无法满足快速识别的需求，而基于核酸的检测技术以其高灵敏性和特异性成为主流。

样本前处理方法

样本前处理是病毒检测的重要一步，旨在提取目标病毒并去除干扰物质。目前方法包括国际标准ISO15216中的聚乙二醇（PEG）沉淀法、磁性颗粒辅助提取法以及自动化仪器的应用（图1）。传统前处理可靠但耗时，磁性颗粒法快速且提取率高，但需要额外制备步骤，而自动化仪器则在效率与成本间提供平衡。

例如，在提取诺如病毒RNA时，磁性颗粒法结合多聚糖或蛋白配基能显著提高病毒回收率，而自动化仪器（如QIAcube®）则在标准流程中大幅减少人工操作。

图1 从食品样品中回收病毒和提取核酸的当前预处理方法的流程图。PEG，聚乙二醇；猪胃粘蛋白^[1]。

基于PCR的检测技术

PCR技术被认为是食源性病毒检测的金标准。实时定量PCR（RT-qPCR）已被用于检测如HAV和NoV等RNA病毒。此方法通过荧光染料或探针实时监测扩增反应，具有快速灵敏的特点。然而，复杂食品基质中的PCR抑制剂（如多糖、蛋白等）对灵敏度造成影响，需要通过样本稀释或超速离心等步骤加以克服。

数字PCR（dPCR）作为RT-qPCR的替代技术，通过将样本分割为大量微小反应，提高了抗干扰能力，适合低病毒载量食品的检测。此外，数字PCR还可实现多重病毒的同时检测。

二、等温扩增技术与未来发展

传统PCR方法需要复杂的温控设备，而等温扩增技术则通过恒温条件下的核酸扩增实现了便携化操作，适合现场检测（POCT）（图2）。例如：环介导等温扩增（LAMP）：通过四个引物识别目标核酸的多个位点，实现快速高效扩增，并可结合浊度、荧光或比色检测。纸基LAMP技术的开发进一步简化了流程，仅需30分钟即可完成目标基因扩增和检测。重组酶扩增（RPA）：在37-42℃下完成扩增，操作简单、设备需求低，总时间可缩短至20分钟。此外，核酸序列扩增法（NASBA）和滚环扩增法（RCA）等也逐步应用于特定病毒的现场检测。尽管创新技术显著提升了检测效率，部分方法如LAMP和RPA仍面临设计复杂、检测特异性受限等挑战。未来研究需优化引物设计，提升多重检测能力，并加强对食品基质影响的评估。同时，设备便携性和耗材成本仍是现场检测工具推广的重要限制因素。

图2 (A)轮状病毒即时检测的纸基环介导等温扩增(LAMP)。(B)核酸结合前后的FE-SEM和荧光显微镜图像。(C)传统逆转录LAMP系统和纸基LAMP的检测极限(插图数字图像)。(D)使用临床粪便样本验证具有视觉结果读数的纸基灯^[1]。

应用前景

核酸检测技术的持续发展将为食品安全领域带来变革性影响。特别是等温扩增技术的便携化和经济性有助于普及病毒现场检测。未来结合自动化样本处理设备和物联网技术，核酸检测方法有望成为疫情监测、食品监管和公共健康评估的重要工具。

参考文献：

[1]KimTY,ZhuX,KimSM,etal.Areviewofnucleicacid-baseddetectionmethodsforfoodborneviruses:Samplepretreatmentanddetectiontechniques[J].FoodResearchInternational,2023:113502.