芽孢皮层水解酶CwlJ新调节因子的鉴定及功能解析

芽孢萌发的关键步骤是激活两种功能冗余的皮层水解酶（SleB和CwlJ），它们降解围绕芽孢的特殊皮质肽聚糖。这项研究利用转座子测序来筛选缺乏SleB或CwlJ的芽孢中的合成萌发缺陷突变体。筛选出SafA和SwsB是CwlJ发挥功能所需的蛋白质。SafA是CwlJ在休眠芽孢中积累和保留所必需的。SwsB的确切作用机制仍不清楚。

转座子随机插入突变鉴定芽孢萌发过程中的关键调控基因

该研究利用构建转座子随机插入突变体库，挖掘芽孢萌发过程中的关键调控基因。由于皮层水解酶SleB及CwlJ功能存在冗余。因此，突变体库分别在两个皮层水解酶的缺失菌株中分别进行。在皮层水解酶SleB缺陷型菌株中的转座子测序中，缺乏swsB及safA的插入，说明这两个基因对于皮层水解酶CwlJ的活性是必须的，因为在缺乏皮层水解酶SleB的背景下，再缺失这两个基因，会导致皮层水解酶CwlJ的活性损失，因此芽孢无法萌发，检测不到活菌在该位点的转座子插入。

验证swsB及safA是否是皮层水解酶CwlJ活性所必须的

在缺乏sleB的情况下，缺失swsB及safA导致芽孢活力迅速下降。而只缺乏sleB的情况下，由于有CwlJ代替SleB的功能，因此导致芽孢活力不下降。此实验证明了swsB及safA是皮层水解酶CwlJ所必须的。

相差显微镜观察证实芽孢萌发过程中的皮层水解阶段受到影响

当添加营养物质后，芽孢萌发正常进行，因此导致芽孢由亮相变为暗相。而缺失皮层水解酶后，芽孢萌发出现障碍，而吡啶二羧酸钙的释放正常，因此芽孢转化为灰色，但是不变黑。通过观察双敲除菌株的变化，也证明了SwsB是CwlJ活性所必须的。

芽孢衣蛋白SafA是保持皮层水解酶CwlJ存在芽孢内部所必须的

通过Western blot实验，证明缺失SafA将导致检测不到芽孢中的CwlJ，说明SafA是CwlJ保留在芽孢上所必须的。而SwsB的缺失，不会导致CwlJ的下降。SwsB可能通过修改皮层的结构，影响皮层水解酶CwlJ的活性，但是具体的作用机制尚不清楚。

关键发现

（1）鉴定调控芽孢萌发过程中的新调控因子SwsB及SafA

（2）SafA通过影响皮层水解酶CwlJ的稳定而发挥作用，而SwsB的作用机制尚不清楚。

结论

这项研究鉴定出了新的芽孢萌发过程中的调控因子，为基于芽孢萌发的芽孢控制策略提供了理论基础。芽孢衣蛋白SafA对于皮层水解酶CwlJ的稳定性十分重要，缺失这个蛋白将导致芽孢皮层水解酶CwlJ在芽孢内部的积累水平下降，从而抑制了芽孢的萌发过程。而SwsB不影响皮层水解酶CwlJ的稳定性，推测SwsB可能是通过影响了肽聚糖皮层的结构，从而影响了芽孢皮层水解酶CwlJ的活性。但其具体的作用机制仍不清楚，需要进一步的验证。

参考文献：https://doi.org/10.1128/JB.00668-19