一种基于硫化噬菌体展示纳米抗体的单一生物传感器用于无标签检测食源性病原体的生物传感器

常见的生物污染物即食源性病原体正在对全球人类的健康以及自然环境产生巨大的威胁，因此建立一种能够针对食源性病原体的快速检测技术就十分重要。传统抗体由于氨基酸序列长、蛋白结构复杂，生产时需要复杂的仪器，且只有在真核生物系统中才能实现，因此存在着各种各样的局限性。而纳米抗体可以在微生物系统，如连接在噬菌体上通过侵染大肠杆菌从而大量表达，并且可以通过在噬菌体展示文库中的快速筛选，获得特异性Phage-Nb，与此同时，纳米抗体的理化性质包括溶解度、耐热性和蛋白水解性等也较为稳定，从而使其能够应用于致病菌以及细菌病原体的免疫检测中。

噬菌体展示纳米抗体文库的构建和Phage-Nb-SH的制备

利用灭活的副溶血性弧菌免疫骆驼，经过多次免疫后获得针对副溶血性弧菌的免疫血清，之后通过噬菌体展示纳米抗体的技术建立噬菌体展示纳米抗体文库。对该噬菌体展示文库进行生物淘选、阳性克隆鉴定获得Phage-Nb，再对Phage-Nb进行硫醇化处理获得Phage-Nb-SH。噬菌体表面的巯基会使得金纳米粒子发生聚集，而纳米抗体和副溶血性弧菌的特异性结合所形成的空间位阻又会阻止金纳米粒子的团聚。从而使加入金纳米粒子的溶液颜色发生变化，最终使得针对副溶血性弧菌的检测系统具有了可视化这一优点同时也成功构建了一步无标记的比色生物传感器。

构建检测副溶血性弧菌检测用的一步比色免疫分析传感器

要构建针对于副溶血性弧菌一步法无标记的比色免疫传感器。首先要确定副溶血性弧菌和Phage-Nb-SH对金纳米粒子AuNPS聚集状态的影响，以及灭活和活化的副溶血性弧菌和Phage-Nb-SH的特异性结合活性。利用荧光染料DAPI对灭活的和活化的副溶血性弧菌进行标记染色，用FITC对Phage-Nb20-SH进行标记，混合后在常温下孵育30分钟，通过激光扫描共聚焦荧光显微镜发现灭活和活化的副溶血性弧菌都能够很好地和Phage-Nb20-SH发生相互作用，即红色荧光的Phage-Nb20-SH能够很好地吸附在具有蓝色荧光的副溶血性弧菌上。

实际样品中副溶血性弧菌的检测

在针对实际样品中所含有的副溶血性弧菌的检测中，由于食物中所含有的可溶性物质溶于水后会影响最终的回收率，所以对样品中的基质效应进行评估。即通过设置几个已知的副溶血性弧菌的浓度梯度，加入到不含副溶血性弧菌的实际样品中建立校正曲线。结果发现用副溶血性弧菌标准品溶液得到的标准曲线与校正曲线拟合良好，因此测试样品中没有出现基质效应。利用上述实验中针对副溶血性弧菌的生物传感器结合比色免疫分析法分析处理了9种常见的食源性病原体包括金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、伦敦沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、痢疾杆菌、大肠杆菌、河流弧菌、创伤弧菌和霍乱弧菌，发现该体系对于副溶血弧菌有着良好的特异性。

关键发现

开发了一种简单、灵敏的副溶血性弧菌比色免疫传感器。该方法可在100 min内完成，可视化检测限为104cfu/m L，定量检测限为103 cfu/ml，且与其他细菌无交叉反应。该方法充分利用了Phage-Nb的高度特异性以及AuNPs的光学特性，实现了对细菌病原体的简单快速检测。

结论

成功构建了基于巯基化噬菌体展示纳米抗体诱导的金纳米粒子聚集的新型生物传感器。实现对于食源性病原体即副溶血性弧菌的灵敏、快捷检测，所构建的体系对于副溶血性弧菌有着良好的特异性与选择性。在该体系中所加入的phage-Nb20经过硫化处理后，能够利用连接在其衣壳蛋白上的巯基很好的诱导金纳米粒子的聚集，而phage-Nb20与目标待测病原体的特异性结合又能够产生相应的空间位阻导致金纳米粒子的分散，使得溶液的颜色发生相应的变化。在最优条件下，该生物传感器在100 min内实现了104 cfu /ml的可视化检测限和103 cfu /ml的定量检测限。此外，未观察到对其他常见病原体的交叉反应。最终对食源性病原体未来的现场快速检测提供了一种非常有前景的技术方法。

文献来源

https://www.engineeringvillage.com/app/doc/?docid=cpx_M1ef3c671842f9b172dM5e761017816355