非靶向与靶向测序技术在污水病毒监测中的应用

污水监测是公共卫生预警的关键手段，可反映社区内传染病的流行情况。自 COVID-19 疫情以来，基于污水的流行病学迅速发展，被广泛用于监测呼吸道合胞病毒、流感病毒、诺如病毒等季节性病原体。然而，污水环境复杂，人类病毒丰度低，传统宏基因组测序面临诸多挑战，如非特异性扩增、数据处理量大、低丰度病毒漏检等。

发表在《water research》杂志的一项研究比较了两者的差异（图1）。研究采集污水处理厂12份未经处理的污水样本，每周1次，覆盖3个截流点。通过聚乙二醇（PEG）沉淀法浓缩病毒颗粒，采样靶向和非靶向两种方式：1.非靶向扩增：MDA/RT-MDA等温扩增技术，用于检测 DNA 和 RNA 病毒，采用 Nanopore PromethION 平台测序。基于 PCR 的随机扩增，采用 Illumina NovaSeq 平台测序。2.靶向富集：Twist 病毒探针 panel通过杂交捕获人类病毒序列，采用Illumina 测序。随后，Nanopore 数据使用 Flye 组装，Illumina 数据使用 MEGAHIT 组装，再通过 Diamond、Kraken2、VirSorter2、geNomad 四种工具鉴定病毒，并与自定义人类病毒数据库（Swiss-Prot）进行比对。利用 ddPCR 技术验证呼吸道合胞病毒、诺如病毒和新冠病毒的存在。

图1 废水中病毒多样性检测的非靶向和靶向测序工作流程图（引自参考文献）

结果显示在序列产出方面，PCR随机扩增产出最高（平均41.3 Gbp/样本），Twist次之（26.5 Gbp）。非靶向方法大于10,000 bp占比7.88–9.00%，而靶向方法未检出>10,000 bp的长片段（图2）。

图2 非靶向和靶向测序数据中获得的contigs数量及长度

非靶向方法主要检测到噬菌体，人类病毒占比低。靶向方法则富集到人类肠道病毒（星状病毒科、杯状病毒科、呼肠孤病毒科），其中RNA病毒丰度更高。共检测到 45 种人类病毒，其中8种（如甲型冠状病毒、轮状病毒）仅在靶向方法中发现，7种（如环病毒、黄病毒）仅在非靶向方法中存在。结果显示靶向方法对肠道病毒（如诺如病毒、轮状病毒）检测效果更佳，非靶向方法则在发现新型或低丰度病毒（如环病毒）方面具有优势。对于省心分析工具而言，Diamond/Blastx 可以检测到更多病毒contigs，geNomad 保守但与 Kraken2 结果相似，VirSorter2 则更适用于识别新型病毒。

综上，靶向方法高效富集已知人类病毒，尤其适用于肠道和呼吸道病原体的监测，但可能漏检低丰度或新型病毒，且成本较高。非靶向方法适用于检测病毒多样性，适合发现新型病毒或未知病原体，但受噬菌体干扰，数据分析较复杂。未来在成本降低的前提下将两者整合并结合ddPCR验证，可精准监测废水中已知病毒和新发病毒，为公共卫生决策提供多维数据支持。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.watres.2025.123803