炎症性肠病结肠黏膜病毒组揭示 Crassvirales 耗竭和疾病特异性病毒组特征

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是危害全球养猪业的重要病原体，造成巨大经济损失。自1995年我国首次报告PRRSV经典毒株（CH-1a）疫情以来，高致病性毒株（HP-PRRSV）以及类NADC30、类NADC34等变异株不断出现。当前，PRRS减毒活疫苗（MLV）还是防控PRRSV的主要手段。MLV的制备是通过分离临床强毒株之后，在Marc-145细胞连续传代致弱获得。例如，我国第一个商品化PRRSV疫苗株CH-1R是在中国农业科学院哈尔滨兽医研究所蔡雪辉研究员的带领下，将CH-1a经过Marc-145细胞连续传代160余次获得的疫苗株。目前，关于PRRSV的致弱机制尚不明确，严重制约PRRSV疫苗的研发速度。近日，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所在病毒学期刊Journal of Virology发表研究，阐明PRRSV-2弱毒活疫苗的致弱机制，并提出新型的疫苗快速研发策略。研究题为：Nsp2 Replicase-Mediated Viral Uncoating in Porcine Alveolar Macrophages Contributes to the Attenuation of PRRSV-2 Live Attenuated Vaccines。

PRRSV在猪肺泡巨噬细胞（PAMs）中的复制效率与其体内毒力密切相关。因此，研究人员选择了商品化的PRRS MLVs以及高致病性PRRSV毒株HuN4作为对照，评估了其在不同细胞上的复制能力。结果表明：PRRS MLVs在Marc-145细胞中的复制效率高于HuN4毒株。然而，商品化的PRRS MLVs在PAMs中的复制效率极低，几乎丧失了在原代PAMs中的复制能力（图1）。

图1. PRRSV弱毒疫苗在PAM与Marc-145细胞中复制情况。

随后，研究人员探讨了PRRS MLVs在感染PAMs过程中，病毒复制周期的哪个阶段出现异常，导致其在原代PAMs中的复制缺陷。研究结果表明：商品化PRRS MLVs与HuN4毒株能够附着PAMs细胞，并内化进入PAMs细胞，最终成功进入早期内体（图2）。然而，PRRSV野毒株与疫苗株均无法进入晚期内体。

图2. PRRSVMLVs在PAM中的定位。

商品化疫苗株在PAMs中不能正常完成基因组复制和病毒蛋白合成，但通过转染感染性克隆质粒，可以检测到病毒的复制，表明病毒基因组合成之后，PAMs细胞中的病毒复制可以正常完成（图3）。因此，MLV在PAM细胞中无法有效复制应该发生在病毒RNA基因组释放之前。

图3. PRRSVMLVs在PAM中复制缺陷阶段的确定。

以上结果表明，MLV可能失去了在PAM细胞中完成脱壳的能力。通过病毒粒子DiD染色，追踪病毒囊膜与细胞内膜系统的融合情况。发现PRRS MLVs的病毒囊膜在与PAM细胞的融合过程中受到抑制，导致其无法顺利完成脱壳（图4）。

图4. PRRSV弱毒疫苗在PAM中脱壳发生缺陷。

此外，通过感染性克隆技术对疫苗株CH-1R与野毒株HuN4的相关区域，研究了影响PRRSV在PAMs中嗜性的关键基因。结果表明，PRRS MLVs在PAMs中的复制缺陷与非结构蛋白2（nsp2）相关，而非病毒囊膜蛋白。研究者还发现，疫苗株感染PAMs后，nsp2在病毒脱壳过程中起着至关重要的作用（图5）。

图5.Nsp2 决定PAM细胞中脱壳

以上结果表明：nsp2是导致PRRS MLVs在PAMs中复制缺陷的关键基因。随后，研究人员进一步探讨了nsp2是否为PRRS MLVs致弱的关键毒力基因。通过动物实验评估CH-nsp2和HC-nsp2嵌合病毒对仔猪的致病性，并以CH-1R和HuN4毒株作为对照。结果显示，与亲本毒株HuN4相比，HC-nsp2对仔猪的致病性显著降低。接种HC-nsp2的仔猪在整个感染过程中未出现发热、呼吸困难、精神萎靡及食欲减退等高致病性PRRS的典型临床症状，也未观察到仔猪死亡。此外，HC-nsp2接种组仔猪的病毒血症水平显著低于HuN4组（图6）。这些结果表明，nsp2在PRRS MLVs的毒力致弱过程中发挥了关键作用。值得注意的是，与CH-1R相比，CH-nsp2的致病性并无显著提升，这提示CH-1R的毒力减弱可能由多个基因共同决定。

图6.Nsp2 决定PRRSV毒力。

鉴于PRRSV持续变异和重组，迫切需要开发针对新流行PRRSV的MLVs。传统弱毒疫苗致弱周期长，不利于疫病防控。急需通用的PRRSV快速致弱策略。由于HC-nsp2对仔猪无致病性，因此评估了其作为疫苗候选株的潜力。实验结果显示，免疫HC-nsp2的仔猪在强毒力毒株HuN4攻毒后，未出现明显PRRS临床症状，也未发生仔猪死亡。与免疫DMEM的HuN4攻毒组相比，HC-nsp2免疫攻毒组的病毒血症以及病理损伤显著降低（图7）。

图7.替换疫苗毒nsp2可对HuN4强毒株提供免疫保护。

这些结果表明：通过替换nsp2基因，可以实现高致病性毒株的快速致弱，为野毒株提供良好的临床保护。因此，本研究提供了PRRSV减毒活疫苗的快速研发策略，对未来PRRSV减毒活疫苗的开发以及指导规模化养猪场的PRRSV驯化具有重要的参考意义。