细菌抗药性危机有解？研究表明：新型lasso肽类抗生素通过独特机制抑制细菌生长，且对人类细胞无毒性！

在《Nature》期刊发表的这篇文章中，加拿大和美国的联合科研团队探讨了一种名为lariocidin的新型lasso肽类抗生素及其衍生物lariocidin B。这些化合物由Paenibacillus sp. M2菌株产生，具有广谱抗菌活性，能够抑制多种细菌病原体的生长。研究表明，lariocidins通过结合细菌核糖体并干扰蛋白质合成来抑制细菌生长。结构、遗传和生化数据表明，lariocidins结合在小核糖体亚基的一个独特位点，与16S核糖体RNA和氨酰-tRNA相互作用，抑制转位并诱导错误编码。值得注意的是，lariocidin不受常见的抗性机制影响，产生自发抗性的可能性低，对人类细胞无毒，并在小鼠鲍曼不动杆菌感染模型中表现出强效的体内活性。这项研究揭示了核糖体靶向lasso肽类抗生素的新途径，为开发急需的抗菌药物提供了一种新型化学骨架。

01研究背景

抗生素耐药性是全球面临的重大危机，2019年因耐药性导致的死亡人数超过450万，严重威胁到我们有效治疗细菌感染的能力。因此，发现新的抗菌化合物，尤其是针对被世界卫生组织列为关键威胁的革兰氏阴性菌的化合物，成为当务之急。多种微生物产生的基于肽的抗生素，如糖肽类（如万古霉素）、阳离子肽（如多粘菌素）和β-内酰胺类（如青霉素和头孢菌素）已成功用于治疗由细菌病原体引起的疾病。大多数医学上相关的肽类抗生素是通过非核糖体途径合成的，涉及抗生素产生菌和真菌基因组中编码的专门肽合成酶装配线。

核糖体合成并经过翻译后修饰的肽（RiPPs）是快速扩展的一类抗生素。这些具有生物活性的天然产物通过核糖体翻译编码肽基因，并通过专门的酶对前体肽进行后续加工，引入多种翻译后修饰，包括分子内环化、脱水和杂环形成。这些修饰设定了肽的三维形状，促进其与靶标的相互作用，并保护其免受细胞肽酶的降解。套索肽是RiPPs的一种，具有独特的三维形状，其C端尾部穿过由N端骨架氨基和内部Asp或Glu残基侧链羧基形成的异肽键构成的分子内环。结果是一个高度稳定的空间打结结构，使这一类肽得名。已知的几种套索肽具有抗菌特性。例如，lassomycin靶向微生物ClpP蛋白酶并表现出抗分枝杆菌活性，而microcin J25和capistruin对革兰氏阴性菌有效，能阻止RNA聚合酶的作用。然而，尚无套索肽被证明可作用于核糖体。

02研究发现

研究团队发现了一种新型的lasso肽类抗生素，名为lariocidin（LAR），及其衍生物lariocidin B（LAR-B），由Paenibacillus sp. M2菌株产生。这些化合物具有广谱抗菌活性，能够通过结合细菌核糖体并干扰蛋白质合成来抑制细菌生长。结构和生化分析表明，lariocidins结合在小核糖体亚基的一个独特位点，与16S核糖体RNA和氨酰-tRNA相互作用，从而抑制转位并引发错误编码。LAR对常见的抗性机制不敏感，生成自发抗性的可能性低，对人类细胞无毒性，并在小鼠鲍曼不动杆菌感染模型中显示出强效的体内活性。

LAR的发现揭示了以核糖体为靶点的lasso肽的新途径，为开发急需的抗菌药物提供了新的化学结构框架。LAR通过限制30S亚基的结构重排来抑制EF-G催化的转位，并通过与氨酰-tRNA的相互作用可能导致错误编码。由于其独特的结构和结合模式，LAR对导致其他核糖体靶向抗生素高水平抗性的突变或酶抗性机制不敏感。LAR在营养限制条件下表现出显著的活性改善，表明其在体内条件下的潜在应用价值。

03临床意义

新型抗菌机制：Lariocidin通过独特的方式与核糖体小亚基的16S rRNA及氨酰tRNA结合，抑制蛋白质合成中的转位步骤并引发错译。这种作用机制不同于目前已知的抗生素作用方式，为开发新型抗生素提供了新的靶点。  广谱抗菌活性：Lariocidin针对多种革兰氏阳性和阴性细菌，包括对多药耐药的临床病原体如鲍曼不动杆菌表现出显著的抗菌活性，尤其在营养限制的环境中效果更佳。这表明LAR在治疗复杂细菌感染时具有潜在应用价值。  低耐药性倾向：Lariocidin不易产生自发耐药性，并且不受常见的耐药机制影响。这一特性对于抗击抗生素耐药性危机至关重要，有望延长抗生素的临床有效期。  低毒性：研究显示Lariocidin对人类细胞无毒性，这为其作为安全的治疗选择奠定了基础。  动物模型验证：在小鼠感染模型中，Lariocidin展示了对多药耐药鲍曼不动杆菌的强效体内活性，显著减少了细菌负担并提高了生存率，支持其作为潜在临床抗生素的开发。  总之，Lariocidin的发现不仅为抗生素开发提供了新的化学骨架，还展示了其在抗击严重细菌感染中的潜力，可为解决抗生素耐药性危机提供新的解决方案。

04实验策略

1. 筛选与鉴定：研究人员通过长时间培养环境细菌菌株，筛选出具有抗菌活性的菌株Paenibacillus sp. M2。通过基因组测序和生物活性引导的纯化，识别出LAR为活性化合物。

2. 结构与功能研究：通过结构、遗传和生化分析，证明LAR通过与细菌核糖体结合来抑制蛋白质合成，具体通过与16S rRNA和氨酰-tRNA相互作用，阻碍转位并诱导误码。

3. 抗性机制与靶点分析：通过选择自发性耐药突变体和全基因组测序，发现LAR的抗性突变主要位于16S rRNA的h31和h34螺旋，这些发现定位了LAR在核糖体上的新结合位点。

4. 体外和体内活性测试：LAR在小鼠鲍曼不动杆菌感染模型中表现出强效的体内活性，并且显示出对人类细胞无毒性。

5. 异源表达：通过在Streptomyces lividans中异源表达LAR的生物合成基因簇（BGC），验证了该基因簇包含合成和分泌LAR所需的全部基因。

6. 结构解析：通过X射线晶体学，解析了LAR和LAR-B与核糖体的结合结构，揭示了其独特的结合模式和作用机制。

05数据解读

图1：LAR及其生物合成基因簇

Figure 1 展示了LAR及其变体的生物合成过程和异源表达分析，重点在于LAR生物合成基因簇（BGC）的组成及其在异源宿主中的表达。  a. 为了揭示LAR的生物合成机制，作者分析了lrc BGC的基因组成及其后翻译修饰过程。LrcA前体肽经过LrcB1和LrcB2识别并切割引导肽，随后LrcC进行环化，LrcF切割末端甘氨酸生成LAR-B和LAR-C变体。目前尚不清楚LAR-B的第二个异肽键是如何形成的。  b. 为了分析LAR在异源宿主中的表达，作者在S. lividans中异源表达lrc BGC，并通过阳离子交换色谱分析细胞游离上清液中的LAR。图中显示的色谱分析结果表明，约12.5分钟的主要峰对应于LAR，经质谱确认。SL-Lrc为转化了pIJ10257-lrc的S. lividans；M2对照为从原始生产者Paenibacillus M2中纯化的LAR；SL-对照为转化了空载体的S. lividans。  c. 为了确认LAR的不同变体，作者通过液相色谱-质谱（LC-MS）分析从异源宿主中纯化的LAR，结果显示生成了三种异构体：LAR（m/z = 936.039）、LAR-B（m/z = 898.523）和LAR-C（m/z = 907.528）。所有显示的质量为[M + 2H]2+离子。  d. 为了探讨LrcF在LAR变体生物合成中的作用，作者分析了在lrc operon中删除lrcF基因的异源宿主中产生的LAR。LC-MS分析显示，仅生成LAR，而不生成LAR-B和LAR-C变体，这表明LrcF在这些变体的生物合成中起作用。  结论：LAR的生物合成涉及多个基因和蛋白质的协同作用，LrcF在LAR-B和LAR-C变体的生成中起关键作用。通过异源表达和质谱分析，明确了LAR及其变体的生成过程。

图2：LAR表现出杀菌活性并靶向细菌蛋白质合成

Figure 2 研究了LAR对细菌的杀菌活性及其对细菌蛋白质合成的影响。  A. 为了评估LAR对细菌的杀菌活性，作者对大肠杆菌培养物进行了处理，使用LAR（10倍最低抑菌浓度，40 μg/ml）或细胞膜靶向裂解抗生素多粘菌素（10倍最低抑菌浓度，5 μg/ml），通过菌落形成单位（cfu）的减少来测量。结果显示，LAR显著减少了大肠杆菌的菌落形成单位。  B. 为了研究LAR对大肠杆菌指数期培养物密度的影响，作者使用LAR或多粘菌素进行处理。结果表明，LAR和多粘菌素均降低了大肠杆菌的培养密度。  C. 通过碘化丙啶（PI）积累实验评估LAR对细胞通透性的影响。实验中，Y轴代表相对荧光单位（RFU），并以时间0的初始荧光进行标准化。结果显示，LAR增加了细胞通透性，多粘菌素作为阳性对照。  D. LAR-BODIPY在大肠杆菌细胞的细胞质中被发现。绿色代表LAR-BODIPY荧光，红色为膜染料FM4-64，蓝色为DNA染料Hoechst 33342。图像代表了三次实验的结果。  E-F. 为了研究LAR对蛋白质合成的影响，作者在无细胞转录-翻译系统中使用编码萤火虫荧光素酶（Luc）或GFP的质粒进行实验。结果显示，LAR抑制了蛋白质合成。  G. 在兔视网膜溶解物中，使用luc mRNA编程，研究LAR对蛋白质合成的影响。结果表明，LAR抑制了蛋白质合成。  H. 通过转位抑制实验，研究LAR对mRNA-tRNA复合物通过核糖体运动的干扰。结果显示，LAR和已知的转位抑制剂negamycin（NEG）均干扰了mRNA-tRNA复合物的转位。  I. 通过趾印分析，研究LAR对核糖体在模型mRNA上的停滞。翻译起始抑制剂retapamulin（RET）作为对照。结果显示，LAR导致核糖体在起始密码子和内部密码子处停滞。  J. LAR诱导错误编码，表现为携带提前终止密码子的lacZ基因的大肠杆菌细胞能够产生功能性β-半乳糖苷酶（可视化为生长抑制区边缘的蓝色光晕）。诱导错误编码的庆大霉素（GEN）和链霉素（STR）作为阳性对照，氯霉素（CHL）作为阴性对照。  结论：LAR具有显著的杀菌活性，并通过干扰细菌蛋白质合成的多种机制来实现这一效果。

图3：与核糖体结合的LAR和LAR-B的结构及电子密度图

Figure 3 展示了LAR和其异构体LAR-B与核糖体结合的结构细节。   图3a和3c提供了LAR和LAR-B的示意性结构图。图中标记了N-端前7个氨基酸（黄色）、分支点（红色，第8位氨基酸）以及C-末端残基9到18（蓝色）。LAR-B中形成第二个异肽键的Lys2的颜色为橙色。 图3b和3d显示了分别与菌核糖体形成复合物的LAR和LAR-B的2Fo−Fc傅里叶电子密度图，电子密度图用蓝色网格表示。LAR及其异构体的精炼模型显示在其各自的电子密度图中，轮廓线为1.0σ。 通过这些图像，研究人员可以准确地观察到LAR和LAR-B与细菌核糖体相互作用的模式，尤其是如何嵌入到小核糖体亚单位中的。这些细节证实了LAR类套索肽与核糖体结合的独特方式，为进一步开发此类抗菌药物提供了分子基础。研究还指出，LAR-B由于其特有的第二个异肽键形成了双套索结构，可能具有更高的热力学和代谢稳定性，对未来的药物开发提供了重要线索。

图4：LAR与温泉菌70S核糖体复合物的结构

Figure 4 详细展示了LAR（lariocidin）在细菌核糖体小亚单位上的结合位点和结合方式，以及与核糖体和转运RNA（tRNA）的相互作用。  图4a和4b给出了LAR在细菌核糖体上结合位点的概览，从不同的视角展示了它与核糖体小（30S）和大亚单位（50S）、信使RNA（mRNA）、以及A、P、E位tRNA的关系。LAR的结合位置紧邻解码中心。  图4c详细展示了LAR如何与小核糖体亚单位相互作用。LAR与16S rRNA的h31、h32和h34螺旋之间形成多种接触。其芳香侧链Phe11通过π–π堆积与U531碱基形成相互作用。  图4d与图4c类似，但重点强调了LAR与mRNA碱基之间的相互作用，虽然主要是与16S rRNA的磷酸糖骨架接触，而非直接与碱基相互作用。这种互动模式解释了LAR抗性突变对其最小抑菌浓度（MIC）影响较小。  图4e和4f展示了以小核糖体亚单位解码中心为目标的几种抗生素（如odilorhabdin、四环素、奈替米星、链霉素和巴龙霉素）的结合位点与LAR的结合位点的对比。LAR的结合位点与这些抗生素明显不同，仅有odilorhabdin部分重叠。  通过这些结构研究，可以看出LAR具有独特的结合模式，与现有的其他小核糖体亚单位靶向抗生素有显著不同。这一点使得LAR在潜在的临床应用中可能具有新的优势，尤其是在对抗耐药性菌株时。

图5：LAR在小鼠中性粒细胞减少性大腿感染模型中的治疗效果

Figure 5 为了评估LAR在小鼠中性粒细胞减少性大腿感染模型中的治疗效果，研究人员对感染鲍曼不动杆菌C0286的小鼠进行了LAR治疗，并观察其对细菌负担和存活率的影响。  A. 为了评估LAR对脾脏细菌负担的影响，研究人员在感染后1小时、4小时、8小时和20小时通过腹腔注射给予小鼠50 mg/kg的LAR。结果显示，与对照组（n=21）相比，LAR治疗组（n=15）在感染后24小时和48小时脾脏中的细菌负担显著降低。  B. 为了评估LAR对大腿部位细菌负担的影响，研究人员在相同的时间点和剂量下给予LAR。结果表明，与对照组（n=32）相比，LAR治疗组（n=30）在感染后24小时和48小时大腿部位的细菌负担显著降低。  C. 为了评估LAR对血液细菌负担的影响，研究人员在相同的时间点和剂量下给予LAR。结果显示，与对照组（n=10）相比，LAR治疗组（n=8）在感染后24小时和48小时血液中的细菌负担显著降低。  D. 为了评估LAR对小鼠存活率的影响，研究人员使用Kaplan-Meier生存分析法比较了LAR治疗组和对照组在感染过程中的存活情况。结果表明，LAR治疗组（n=8）在感染后存活率显著高于对照组（n=10）。  结论：LAR在小鼠中性粒细胞减少性大腿感染模型中显著降低了细菌负担，并提高了小鼠的存活率，显示出其良好的治疗效果。

06主要结论

这项研究揭示了由Paenibacillus sp. M2菌株产生的lasso肽抗生素lariocidin及其衍生物lariocidin B。这些化合物对多种细菌病原体具有广谱活性。研究表明，lariocidins通过与核糖体结合并干扰蛋白质合成来抑制细菌生长。具体而言，lariocidins结合在小核糖体亚基的一个独特位点，与16S核糖体RNA和氨酰-tRNA相互作用，从而抑制转位并引发错误编码。Lariocidin不受常见的耐药机制影响，产生自发性耐药的可能性较低，对人类细胞无毒性，并在小鼠鲍曼不动杆菌感染模型中表现出强效的体内活性。这一发现为开发新的蛋白质合成抑制剂提供了新的途径，并为开发急需的抗菌药物提供了新的化学骨架。

07讨论总结

在抗菌药物耐药性危机的背景下，研究新型抗菌化合物是当务之急。研究表明，lariocidin是一种独特的lasso肽，它通过结合核糖体并干扰蛋白质合成来抑制细菌生长，同时引发错误编码。其特殊的结合位点使其对现有核糖体靶向抗生素的耐药性交叉较少。此外，lariocidin的结构稳定性和广谱活性使其成为一种有前途的抗菌药物候选者。研究还强调了其在营养限制条件下的增强活性，提示在体内环境中具有更好的药效表现。通过在异源宿主中表达，并结合结构和功能分析，为进一步优化lariocidin及其类似物提供了基础，从而为解决抗生素耐药性危机提供新的希望。