一种疗法针对所有病毒变种？研究表明：CIM-834可阻断病毒组装，有效抑制多种变种！

在《Nature》期刊发表的这篇文章中，比利时的科研团队研究了一种名为CIM-834的新型化合物，该化合物通过靶向冠状病毒膜蛋白(M)来抑制SARS-CoV-2的组装。研究表明，CIM-834能够有效抑制SARS-CoV-2及其多种变体的复制，并在SARS-CoV中也表现出抑制效果。在SCID小鼠和叙利亚仓鼠的体内实验中，口服CIM-834显著降低了肺部的病毒滴度，甚至在治疗延迟至实验终点前24小时才开始时也能取得良好效果。此外，CIM-834的治疗能够阻止感染仓鼠将病毒传播给未治疗的哨兵动物。透射电子显微镜研究显示，CIM-834处理的细胞中完全没有病毒颗粒的组装。单颗粒冷冻电子显微镜分析揭示，CIM-834通过结合并稳定M蛋白的短形式，阻止其向长形式的构象转换，从而阻止病毒颗粒的成功组装。总之，该研究发现了冠状病毒复制周期中的一个新药物靶点，并开发了一种强效抑制该靶点的小分子。

01研究背景

近年来，三种对人类具有高度致病性的冠状病毒相继出现：2002年的严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）、2012年的中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）以及2019年的SARS-CoV-2。SARS-CoV的平均病死率约为10%，而MERS-CoV则高达36%。截至目前，由SARS-CoV-2引发的COVID-19疫情已导致约700万例确诊死亡和约2800万例估计死亡。至少10%的COVID-19患者会发展为“长新冠”，即初次感染后数月内症状持续或出现新症状。在SARS-CoV出现后，研究人员致力于开发冠状病毒主蛋白酶（Mpro或3CLpro）的抑制剂，这为20年后快速开发具有广谱冠状病毒覆盖的Mpro抑制剂nirmatrelvir奠定了基础。若在COVID-19症状出现五天内开始使用nirmatrelvir治疗（与药代动力学增强剂ritonavir联合使用），可将死亡率和住院率降低约90%。此外，remdesivir和molnupiravir是核苷类似物的前药，分别通过靶向病毒RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）和诱导错误灾变发挥作用。这些药物最初为治疗其他病毒感染而开发，因其相对广谱的抗病毒活性而被重新用于治疗SARS-CoV-2感染。然而，由于药物相互作用、静脉注射需求或疗效不佳，nirmatrelvir/ritonavir、remdesivir和molnupiravir的使用受到限制。

在COVID-19背景下，为应对新型高致病性冠状病毒，识别冠状病毒复制周期中的新抑制剂和新药物靶点仍然至关重要。具有非重叠耐药谱的抗病毒药物非常适合开发（固定剂量）组合，以避免抗病毒药物耐药性的产生。除了基于靶点的药物设计，表型抗病毒筛选能够发现病毒复制周期中尚未被认为可成药的其他靶点。通过筛选大型小分子库，可以识别出抑制病毒复制且细胞毒性最小的化合物。一旦通过药物化学改进了这些分子的效力和选择性，便可揭示其分子机制，从而有可能识别出新的可成药靶点。这一策略已成功识别出靶向丙型肝炎病毒NS5A蛋白的高效抑制剂，以及发现了一类高效的泛血清型登革病毒抑制剂。我们采用相同的策略（高通量筛选和命中优化）发现了CIM-834，这是一种口服有效的首创小分子装配抑制剂，针对SARS-CoV-2和SARS-CoV的病毒M蛋白。M蛋白是病毒包膜中最丰富的结构蛋白，被认为是冠状病毒装配的主要驱动因素。

02研究发现

研究团队发现了一种名为CIM-834的小分子化合物，它能够有效抑制SARS-CoV-2和SARS-CoV的组装。CIM-834通过阻止冠状病毒膜蛋白（M蛋白）从短形式（Mshort）向长形式（Mlong）的构象转换，从而阻止病毒颗粒的组装。该化合物在体外实验中对多种SARS-CoV-2变体表现出强效的抗病毒活性，并且在感染SARS-CoV-2的SCID小鼠和叙利亚仓鼠模型中，口服给药能够显著降低肺部病毒滴度。此外，CIM-834还能够阻止感染仓鼠将病毒传播给未感染的同伴。
通过单颗粒冷冻电子显微镜研究，CIM-834被发现能够结合并稳定M蛋白的短形式，防止其向长形式的转换，这是病毒颗粒成功组装所必需的。该研究揭示了冠状病毒复制周期中的一个新的可药物靶点，即M蛋白，并展示了CIM-834作为一种有效的组装抑制剂的潜力。CIM-834的发现为开发针对冠状病毒的新型抗病毒药物提供了重要的基础。

03临床意义

CIM-834提供了一种新的、可靶向的抗病毒途径，尤其是在现有治疗方案（如蛋白酶和聚合酶抑制剂）效果有限或有耐药性发展的情况下。这种新机制的抗病毒药物不仅可以单独使用，还可以与现有药物联合使用以提高治疗效果并减少耐药性的发展。该研究为未来冠状病毒感染的治疗提供了新的视角和潜在的治疗选择。

04实验策略

1. CIM-834提供了一种新的、可靶向的抗病毒途径，尤其是在现有治疗方案（如蛋白酶和聚合酶抑制剂）效果有限或有耐药性发展的情况下。这种新机制的抗病毒药物不仅可以单独使用，还可以与现有药物联合使用以提高治疗效果并减少耐药性的发展。该研究为未来冠状病毒感染的治疗提供了新的视角和潜在的治疗选择。2. 药物化学优化：在筛选出CIM-834后，研究团队通过结构优化合成了超过500种衍生物，最终确定CIM-834作为工具化合物用于机制研究和体内效力评估。3. 体外抗病毒活性评估：使用VeroE6–GFP和A549ACE2+TMPRSS2细胞系评估CIM-834的抗病毒活性，结果显示其对多种SARS-CoV-2变种和SARS-CoV具有显著的抑制作用，其EC50值与已知的抗病毒药物如nirmatrelvir相当。4. 体内实验：在SCID小鼠和叙利亚仓鼠中进行实验，口服CIM-834显著降低了肺部病毒滴度，并在感染仓鼠中阻止了病毒传播。5. 电子显微镜和冷冻电镜研究：通过电子显微镜观察到经CIM-834处理的细胞中病毒颗粒组装完全缺失。冷冻电镜揭示CIM-834能结合并稳定M蛋白的短形式，从而阻止其转化为长形式，这对于病毒颗粒的成功组装是必需的。

05数据解读

图1：CIM-834抑制SARS-CoV-2和SARS-CoV的复制

Figure 1 研究了CIM-834对SARS-CoV-2和SARS-CoV病毒复制的抑制作用。  A. 图A展示了CIM-834的结构式。  B. 为了评估CIM-834对不同SARS-CoV-2变体和SARS-CoV的抑制效果，研究者在两种不同的细胞系中进行了实验，并将结果与Nirmatrelvir和GS-441524进行了对比。结果显示，CIM-834在这两种细胞系中均有效抑制病毒复制。箱线图展示了中位数、25%和75%分位数，须线表示最大值和最小值，X轴上方标注了独立生物实验的次数。  C. 通过剂量反应曲线分析了CIM-834在A549ACE2+TMPRSS2细胞上的抗病毒活性（彩色线）和细胞毒性（虚线），结果表明CIM-834具有显著的抗病毒活性，且细胞毒性较低。该实验进行了4次独立生物实验，结果以平均值±标准误表示。  D-F. 为了验证CIM-834对SARS-CoV-2 B.1.1.7变体的抑制效果，研究者在气-液界面培养的原代人鼻细胞中进行了实验。结果显示，经过CIM-834处理后，第2天（图E）和第4天（图F）的病毒RNA水平显著降低。实验结果通过Kruskal–Wallis检验和Dunn’s比较分析，显示统计学显著性，实验进行了6次独立生物实验，结果以平均值±标准误表示。  结论：CIM-834能够有效抑制SARS-CoV-2和SARS-CoV的复制，并在多种细胞系和原代人鼻细胞中显示出显著的抗病毒活性。

图2：CIM-834在SARS-CoV-2感染的SCID小鼠和仓鼠中的疗效

Figure 2 研究了CIM-834在SARS-CoV-2感染的SCID小鼠和仓鼠中的抗病毒效果。  a. 为了评估CIM-834在SARS-CoV-2感染中的疗效，作者将SCID小鼠鼻腔内感染SARS-CoV-2 B.1.351，并分别给予CIM-834或nirmatrelvir治疗，每天两次。治疗在感染前（第0天）或感染后指定时间开始。结果显示，CIM-834在感染前或感染后给药均能有效抑制病毒。  b, c. 通过检测感染后3天的小鼠肺部感染滴度和病毒RNA负荷，结果显示，CIM-834治疗组的肺部感染滴度和病毒RNA负荷显著低于对照组，表明CIM-834具有良好的抗病毒效果。  d. 在感染后第3天，作者测量了不同治疗组小鼠的体重变化，结果显示，CIM-834治疗组的小鼠体重变化较小，表明CIM-834能够减轻病毒感染引起的体重下降。  e. 为了进一步验证CIM-834的疗效，作者将叙利亚仓鼠鼻腔内感染SARS-CoV-2 USA-WA1/2020，并连续四天给予CIM-834/ritonavir或nirmatrelvir治疗。感染后一天，治疗后的仓鼠与未治疗的哨兵仓鼠共同饲养。  f. 在感染后第4天，作者检测了仓鼠的肺部感染滴度、病毒RNA负荷和病理评分，结果显示，CIM-834治疗组的肺部感染滴度和病毒RNA负荷显著降低，病理评分也有所改善。  g. 在共同饲养开始三天后，作者检测了未治疗的哨兵仓鼠的肺部感染滴度和病毒RNA负荷，结果显示，与CIM-834治疗组共同饲养的哨兵仓鼠的感染滴度和病毒RNA负荷显著降低。  h. 通过苏木精和伊红染色观察感染后第4天仓鼠肺部的病理变化，结果显示，CIM-834治疗组的肺部炎症和支气管肺炎程度较轻，而对照组则出现明显的支气管和血管区域炎症，以及支气管肺炎。  结论：CIM-834在SARS-CoV-2感染的SCID小鼠和仓鼠中显示出良好的抗病毒效果，能够有效降低病毒负荷和改善病理变化。

图3：M蛋白中的氨基酸替换P132S被CIM-834选择并与抗病毒耐药性相关

Figure 3 研究了SARS-CoV-2病毒在抗病毒药物CIM-834的选择压力下产生的M蛋白氨基酸替换P132S，以及该替换与抗病毒耐药性的关系。  A. 为了研究SARS-CoV-2对CIM-834的耐药性，作者在A549ACE2+TMPRSS2细胞中，通过逐步增加CIM-834浓度传代SARS-CoV-2 B.1.1.7变异株，进行体外耐药性选择实验。  B. P132S替换位于M蛋白的羧基末端病毒内域，表明该位置的氨基酸变化可能影响病毒的结构或功能。  C. 通过反向遗传学方法，将M(P132S)引入SARS-CoV-2武汉株和Omicron BF.7株的背景中，以研究该突变的影响。  D. 在空气-液体界面培养的人鼻上皮气道细胞中，检测rWuhan-WT和M(P132S)突变体的复制动力学。通过不同时间点收集的顶端洗液测定传染性病毒滴度，结果显示M(P132S)突变体的复制能力与野生型相比有变化。  E. 在A549ACE2+TMPRSS2细胞中，检测rWuhan-WT和M(P132S)对CIM-834及参考抑制剂GS-441524和nirmatrelvir的敏感性。通过两因素方差分析（ANOVA）和Sidak多重比较检验比较EC50值，结果显示M(P132S)突变体对CIM-834的敏感性降低。  F. 研究其他M蛋白替换与化合物耐药性的关系，这些突变在Omicron BF.7背景中通过反向工程实现。通过两因素ANOVA和Dunnett多重比较检验比较EC50值，结果显示不同突变体的耐药水平不同。  G. 比较M突变体与野生型病毒的EC50值变化倍数（与图F相同的数据），结果显示P132S突变体的EC50值显著增加，表明其耐药性增强。  结论：M蛋白中的P132S氨基酸替换在CIM-834的选择压力下被选择，并与抗病毒药物的耐药性相关。

图4：CIM-834抑制SARS-CoV-2组装

Figure 4 探讨了CIM-834对SARS-CoV-2病毒组装的抑制作用，通过多种实验方法验证了CIM-834对病毒结构蛋白M的影响。  A. 实验设计展示了VLPs（病毒样颗粒）实验的设置，目的是研究CIM-834对SARS-CoV-2组装的影响。  B-C. 通过免疫印迹实验，作者对野生型M蛋白和M(P132S)突变体的寡聚体与总蛋白的比值进行了定量分析。结果显示，与DMSO对照组相比，CIM-834处理组的M蛋白寡聚体形成显著减少。  D. 代表性的免疫印迹结果展示了M蛋白的表达情况，以微管蛋白作为装载对照。  E-F. 通过免疫印迹检测细胞外M单体的分泌量，计算M在培养基和细胞裂解液中的比例。结果表明，与DMSO对照组相比，CIM-834处理组的野生型M蛋白和M(P132S)突变体的分泌量显著降低。  G. 通过电子显微镜观察，在感染SARS-CoV-2后10小时，DMSO和CIM-834处理细胞的核周区域。结果显示，CIM-834处理组的病毒和病毒组装位点减少，膜结构扩展。  H. 断层扫描重建结果显示，CIM-834处理组中成熟和组装中的病毒颗粒减少，膜曲率和内陷区域减少。  I. 定量分析显示，每1平方微米细胞质区域的双膜囊泡（DMVs）数量、显示（组装中）病毒颗粒的细胞百分比以及具有DMV邻近膜堆积的细胞百分比在CIM-834处理组中显著降低。  J. 提出的CIM-834抗病毒机制：CIM-834通过与M短结合，阻止其构象转换，从而抑制病毒组装。  结论：CIM-834通过抑制M蛋白的构象转换，显著抑制了SARS-CoV-2的组装和释放。 

06主要结论

这篇论文介绍了一种新型冠状病毒装配抑制剂CIM-834，它通过靶向冠状病毒膜蛋白(M)来阻止SARS-CoV-2的装配。通过高通量筛选和药物化学优化获得的CIM-834，能够有效抑制SARS-CoV-2和SARS-CoV的复制。在SCID小鼠和叙利亚仓鼠模型中，口服CIM-834治疗显著降低了肺部病毒滴度，并阻止了病毒的传播。研究表明，CIM-834通过结合并稳定M蛋白的短形式，阻止其转变为长形式，从而抑制病毒颗粒的装配。这表明M蛋白和冠状病毒的装配过程是潜在的药物靶点。

07讨论总结

研究指出冠状病毒复制周期中有许多潜在的药物靶点，而M蛋白就是其中之一。CIM-834通过阻止M蛋白的构象转换来抑制病毒的装配，同时不影响病毒RNA的复制。实验表明，尽管CIM-834不影响vRNA的水平，但它能够显著降低传染性病毒的滴度。此外，CIM-834可以与现有的蛋白酶和聚合酶抑制剂进行联合治疗，以预防抗药性的产生。作者认为CIM-834所在的M靶向分子类别具有进一步优化的潜力，可能扩展其抗病毒谱，包括MERS-CoV等其他冠状病毒。该研究强调了基于高通量表型抗病毒筛选的药物和靶点发现的价值。