基于滚环扩增/G-四链体的双信号比率型电化学适配体传感器用于病原菌的超灵敏检测

本研究构建了一种新型比率型双信号电化学生物传感器，通过适配体识别诱导的滚环扩增与G-四链体策略，实现了对病原菌（如金黄色葡萄球菌）的超高灵敏度检测，检测限低至10 CFU/mL。该传感器利用单个金电极同时监测二茂铁信号的减弱与亚甲蓝信号的增强，通过信号比值定量菌液浓度，显著提高了检测的准确性、稳定性与抗干扰能力，为临床感染性疾病的早期、快速诊断提供了有力工具。 

准确、高效地检测病原菌在感染性疾病诊断中具有关键作用。然而，临床样本中特定细菌的快速、高灵敏度检测仍面临技术挑战。目前常用的细菌检测方法，包括传统生化鉴定、免疫学检测、分子生物学分析及质谱技术等，普遍存在耗时长、操作复杂、样本需求量大等问题，限制了其在特定临床场景中的应用。

为克服上述瓶颈，电化学生物传感器因其高灵敏度、操作简便等特点，在细菌检测领域展现出广阔前景。然而，多数现有传感器仍采用单一信号输出模式，易受电极状态、仪器波动、环境因素等干扰，导致结果稳定性、重现性和可靠性不足。近年来，比率型传感策略应运而生，通过采集两个独立信号的比值作为输出，有效降低背景干扰，显著提升了检测的精准度与鲁棒性。

在该研究中，丁等团队设计了一种基于适配体识别触发滚环扩增与G-四链体结合的比率型电化学传感平台。该传感器以金黄色葡萄球菌为模型目标，构建了双链探针P1-P2修饰的金电极系统。其中，P1为二茂铁标记的适配体识别探针，用于特异性捕获目标细菌；P2为带有巯基修饰的引物序列，用于启动滚环扩增反应。当目标菌存在时，P1与菌体结合后从P1-P2复合物中解离，导致二茂铁信号下降；同时暴露的P2引物在Phi29 DNA聚合酶作用下启动滚环扩增，生成大量富含G碱基的序列，在钾离子存在下折叠形成G-四链体结构，进而结合电化学指示剂亚甲蓝，产生显著放大的第二信号。通过计算亚甲蓝信号与二茂铁信号的比值，即可实现对目标菌浓度的准确定量。

图一  实验原理。基于适配体识别诱导的滚环扩增（RCA）/G-四链体策略的用于病原菌超灵敏检测的比例双信号电化学生物传感器。

研究团队通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、差分脉冲伏安法、循环伏安法和交流阻抗法系统验证了传感器的可行性。在优化实验条件方面，确定了P1-P2互补碱基数为30对、探针浓度为1.5 μM、钾离子浓度为100 mM、滚环扩增时间为2小时等关键参数。在最优条件下，该传感器对金黄色葡萄球菌的检测线性范围为10–10^6 CFU/mL，检测限达10 CFU/mL，远优于多数传统单一信号传感器。

在特异性评估中，该传感器对大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌等其他常见病原菌均无明显响应，显示出优异的选择性。稳定性测试表明，传感器在4°C储存9天后仍能保持稳定的信号输出，相对标准偏差为3.93%。此外，多组平行制备的传感器对同一浓度菌液检测结果高度一致，显示出良好的重现性。

为验证其在真实样本中的适用性，研究还在加标临床样本中进行了检测，结果显示该传感器在不同浓度菌液背景下仍能保持高准确度与稳定性，具备良好的临床应用潜力。

该研究不仅拓展了电化学传感器在病原微生物检测中的应用范围，也为临床感染性疾病的早期诊断与精准用药提供了新的技术思路。其所采用的单电极、双信号、滚环扩增与G-四链体协同放大的策略，具有设计灵活、灵敏度高、适用范围广等特点，未来可适配于其他病原体的检测体系，具有重要的转化前景。

文献链接：https://doi.org/10.1002/celc.202300257