活性污泥系统中溶原性噬菌体与宿主间相互作用的普遍性和功能影响：基于大规模宏基因组学和实验证据的解析

【文献分享】活性污泥系统中溶原性噬菌体与宿主之间相互作用的普遍性和功能影响：基于大规模宏基因组学和实验证据的解析

原名：Prevalence and functional impact of the interactions between lysogenic phages and hosts in activated sludge systems: Insights from large-scale metagenomics and experimental evidence

期刊：Water Research

IF：12.4

发表时间：2025年11月

第一作者：Jie Li

通讯作者：Peng Liu, Xu-xiang Zhang

作者单位：南京大学

摘要

噬菌体是污水处理厂活性污泥中最常见的生物实体，在维持或调节微生物群落中起着重要作用。然而，活性污泥系统中细菌与溶原性噬菌体的相互作用仍知之甚少。本研究通过对五个国家43个全规模污水处理厂（WWTPs）的样本进行宏基因组组装基因组（MAGs）重建，发现活性污泥（AS）中超过55%的MAGs具有溶原性，揭示了溶原性噬菌体与其宿主之间广泛存在的相互作用。此外，溶原性MAGs中嵌入的多种新型原噬菌体形成了复杂的噬菌体-宿主相互作用，噬菌体-宿主网络揭示了原噬菌体与其微生物宿主之间的复杂关系。通过计算机模拟方法和实验验证，我们证实了原噬菌体的可诱导性和活性，表明原噬菌体诱导显著促进了参与有机物好氧氧化的微生物裂解，以及氮磷去除。这项研究开创性的结合了以基因组为中心的大规模宏基因组学研究与实验验证，揭示了溶原性噬菌体-宿主相互作用在AS系统中的主导地位。它推进了我们对原噬菌体在塑造AS微生物组中的关键作用的理解，特别是在影响污染物降解和氮磷去除等微生物过程方面。

引言

活性污泥法（AS）是一种常用的污水处理方法，它利用微生物高效去除有机物及氮、磷等营养物质。AS系统表现出高度的微生物多样性，包括细菌、病毒、真菌和原生生物。然而，病毒是AS系统中至关重要但经常被忽视的组成部分，其浓度可达细菌的10倍。噬菌体通过溶原性或溶解性感染细菌，在塑造AS的微生物群落中发挥关键作用。裂解性噬菌体能在宿主内快速复制，导致宿主细胞裂解并释放子代噬菌体，同时将细胞内容物释放到周围环境中。研究表明，该过程对厌氧消化系统中微生物群落的结构和动态具有深远影响。最近的研究揭示了裂解性噬菌体对AS系统中营养循环的重要贡献。然而，在聚焦裂解性噬菌体的同时，溶原性噬菌体（特别是前噬菌体）的重要性却长期被忽视。

溶原性噬菌体与裂解性噬菌体不同，它们能将自身的DNA整合到宿主染色体中，形成随宿主染色体复制的原噬菌体。这些原噬菌体通常被称为“定时炸弹”，因为当受到温度、毒素或紫外线等外部刺激时，它们便会进入裂解周期。原噬菌体的诱导加剧了对易感细菌种群的捕食压力，并可导致功能性微生物的消亡，最终导致微生物群落的崩溃。例如，邻苯二甲酸丁苄酯的存在会因原噬菌体的诱导而在厌氧消化过程中导致短链脂肪酸的积累。此外，溶原性在细菌与噬菌体持续的进化斗争中起着独特的作用，并由此催生了共生相互作用。最近研究表明，携带砷耐受决定因子的溶原性噬菌体可以促进细菌群落对砷毒性的适应。溶原性噬菌体能为宿主细菌带来各种益处，如增强抗捕食能力、提升遗传多样性和改变代谢能力。因此，溶原性细菌与宿主细菌之间的相互作用显著影响AS微生物组的组成和功能。因此，有必要评估溶原性的程度，并深入研究AS系统中细菌和细菌之间的相互作用机制。

环境和实验室中的细菌菌株主要是溶原菌（定义为基因组中携带至少一个原噬菌体的菌株），但评估自然复杂群落中溶原菌的比例仍然具有挑战性，特别是在具有复杂群落的AS系统中。半个世纪以来，溶原菌的比例通常通过使用DNA损伤剂丝裂霉素C诱导原噬菌体来估算。然而，并不是所有的原噬菌体都能被丝裂霉素C诱导。宏基因组学的快速发展为探索复杂环境中的溶原性提供了新途径。先前基于宏基因组重建基因组的研究表明，溶原现象在小鼠倡导微生物群落中广泛存在。然而，在AS系统中的溶原性现象研究尚不充分，仅有一份公开报道指出：在发生污泥膨胀的实验室规模反应器AS系统中，溶原性宏基因组组装基因组（MAGs）-定义为含有原噬菌体片段的基因组-占比高达61.7%。因此，我们对全规模城市污水处理厂（WWTPs）中溶原性现象的认知仍然是不完整的。

在本研究中，我们收集了来自五个国家43座全规模污水处理厂的AS样品的宏基因组数据集。基于该数据集，我们重建了MAGs以识别和回收原噬菌体，从而解决以下关键问题：（1）溶原菌和噬菌体在AS微生物群落中的普遍性和多样性如何？（2）这些原噬菌体如何与参与碳循环和营养去除的功能性微生物相互作用？本研究利用大规模基因组技术，全面阐明了溶原性噬菌体与AS系统宿主之间相互作用的普遍性。该研究加深了我们对溶原性噬菌体与其宿主之间相互作用的理解，强调了原噬菌体诱导的功能微生物裂解的意义，这种现象可能影响AS系统的稳定性。

材料和方法

从AS样本中收集宏基因组序列数据

本研究中的宏基因组数据集由来自美国、阿根廷、中国、丹麦和新加坡43座全规模污水处理厂的211个AS样本汇编而成（图S1）。原始研究（数据来源）中这些AS样本的收集、处理和DNA提取的详细信息详见补充材料（补充文本S1）。所有原始测序reads均采用Illumina HiSeq平台的配对双端测序策略生成，数据源自欧洲核苷酸档案库及NCBI序列读取档案库。表S1展示了样本和WWTP的详细信息。用于宏基因组分析的配对双端reads总量约2.55 Tb（图S2和表S1）。

噬菌体和溶原性原核生物的鉴定、分类和功能注释

原始宏基因组数据经过修剪、质量过滤、组装和分箱（详见补充文本S2）。使用VirSorter2 v2.2.3和VIBRANT v1.2.1在重建的非冗余MAGs中识别出携带的噬菌体序列（通过95%平均核苷酸同一性阈值去重，完整性≥ 50%且污染≤ 10%）。携带噬菌体序列的MAGs被认为是溶原性MAGs，并被认为是相应噬菌体的宿主。使用GTDB-TK v1.6.0基于基因组分类数据库（202版）完成MAGs的分类分配。使用CD-HIT v4.8.1以95%核苷酸同一性阈值对鉴定出的噬菌体contigs进行整合聚类，形成病毒操作分类单元（vOTUs）。对于vOTUs的分类学分配，使用Prodigal v2.6.3对vOTUs内的开放阅读框（ORFs）进行预测。随后，将预测的蛋白质序列与来自NCBI Viral RefSeq v201数据库中的病毒参考序列进行聚类。与参考基因组聚类的vOTUs被归入对应的病毒分类等级。未与任何参考基因组聚类的vOTUs被标记为“未分类”。为了全面鉴定MAG编码的功能基因，使用综合方法对所有ORF进行了详尽的功能注释。具体信息详见补充材料（补充文本S2）。

MAGs和噬菌体的丰度概况

MAG和噬菌体的相对丰度以每百万个映射reads（RPKM）值中每千碱基reads表示。使用CoverM v0.6.1将每个样本的clean reads比对至噬菌体contigs或MAGs，生成跨样本的覆盖率文件，参数设置为：“-min-read-aligned-percent 75 -m rpkm -min-read-percent-identity 95”。计算过程的详细信息见补充材料（补充文本S3）。

活性噬菌体的鉴定和诱导

噬菌体从休眠的溶原性阶段转变为裂解阶段时被认为处于活跃状态。使用PropagAtE软件基于噬菌体与宿主的读取覆盖率比值及其对应的比值效应大小（采用默认参数）对211份厌氧消化样本中鉴定出的噬菌体的潜在活性进行了计算预测。此外，为了验证在AS系统中发现的噬菌体活性的普遍性，我们从污水处理厂收集了更多的自由生活病毒组样本（登录号PRJNA639411）。当自由生活的病毒组的宏基因组reads能成功比对到噬菌体序列时（通过BLASTn比对，要求> 90%比对率和> 95%同一性），该活性原噬菌体在AS系统中普遍存在。

为了进一步验证结果，我们进行了一个AS诱导实验。详细的计算过程在补充材料中提供（补充文本S4）。在丝裂霉素C诱导前后采集的活性污泥样本用于宏基因组测序。通过离心分离细菌和病毒组分，提取的DNA Illumina NovaSeq 6000平台上使用配对末端测序策略进行测序。测序数据采用上述相同分析流程，用于鉴定溶原性MAGs和噬菌体。为了研究溶原性功能微生物对磷去除的影响，在诱导实验期间的不同孵育时间（0、24和48 h）测量磷酸盐浓度。

统计分析

所有统计分析均使用R v4.2.2和多个软件包进行。使用“ggplot2”和“ggpubr”包对MAG基因组完整性与溶原性百分比和相对丰度的相关性进行分析。我们通过比较每个门中溶原性MAG的比例与整个MAG数据集中的比例来计算比值比（OR）。OR值的计算公式为： 

其中a是特定门中溶原性MAG的数量，b是该门中非溶原性MAG的数量，c是所有门中溶原性MAG的数量，d是所有门中非溶原性MAG的数量。OR大于1表明该门发生溶原性的概率高于MAG总体，小于1则表明概率较低。采用Wilcoxon符号秩检验以分析不同样品间VLP数量的显著差异，p < 0.05被认为是显著的。

结果

溶原性MAGs在AS中普遍存在

为了估算AS中溶原菌的百分比，我们首先构建了一个包含1825个非冗余MAGs的数据集（表S2），这些MAGs来自43个污水处理厂的211份活性污泥样本。这些MAGs的平均完整性和污染度分别为75.1%和2.7%（图S3）。在该数据集中，通过检索完整度至少为50%的MAGs中的噬菌体，发现55.0%的MAGs（1003）是溶原菌（图1a）。就相对丰度而言，溶原菌占总MAGs的59.0%（图1b），高于公开可用的细菌基因组中溶原菌的比例（46.0%-54.0%）。此外，活性污泥中溶原性的比例明显高于其他栖息地，如淡水（9.5%）、海水（16.0%）和沉积物（8.0%）。最近的一项研究也证实了这一结果，表明活性污泥病毒组中溶原性噬菌体的相对丰度高于地表水、海水和沉积物中的水平。值得注意的是，我们观察到溶原性MAGs的比例与基因组完整性之间存在显著正相关，且呈指数趋势（p < 0.05；图1a, b）。这表明在高质量的MAGs中更有可能检测到溶原体，这可能是由于在组装和分箱过程中保留了更多的噬菌体序列。相反，MAG污染和溶原细胞检测之间没有观察到显著相关性（p = 0.27；图S4），表明检测到的噬菌体不太可能是组装伪像或污染物。这进一步支持了我们污染阈值的有效性。为了进一步评估基因组完整性的影响，我们将MAG按完整性区间来进行分层分析（例如50-60%、60-70%、70-80%、80-90%和≥ 0%），并报告各层级中的溶原菌流行率（表S3）。结果显示了明显的完整性依赖性偏倚：溶原性MAG的比例从50-60%区间（44.0%）增加到≥ 90%区间（64.5%），凸显了MAG质量对检测灵敏度的影响。为校正此偏差，我们还计算了逐渐提高完整性阈值（例如，≥50%、≥60%等；表S4）下的溶原菌流行率，并应用指数回归模型估计完全完整基因组的理想情况下的溶原菌流行率。该模型预测64.7%（95% CI：61.6- 67.7%）的MAG具有溶原性，占总丰度的68.7%（95% CI：65.6- 71.7%）（表S4）。这些外推估计值有助于校正完整性偏差，并有助于采用不同MAG质量阈值的研究进行更准确的比较。

 

图1. 不同MAG完整性区间内AS系统中溶原菌的百分比。基于（a）数量和（b）相对丰度计算溶原性MAGs的比例。蓝色字体表示每个完整性区间内MAGs的总数。x轴代表MAGs的完整性阈值，数值表示最低完整性百分比（例如≥50表示完整性≥50%的MAGs）。图a和图b中的每个绿色点分别代表：在满足该完整性阈值的所有MAGs中，溶原性MAGs所占的比例及相对丰度。

如图1所示，完整性≥ 90%的MAGs中溶原菌的百分比和相对丰度较完整性≥ 80%的MAGs略有下降，这部分归因于前者MAGs的数量较少。在先前关于从MAG中检测噬菌体的研究中，我们观察到MAG完整性阈值存在显著差异，范围从30%到80%不等。这种差异凸显了当前缺乏公认的MAG完整性阈值黄金标准用于下游分析。此外，样本量过小可能会导致代表性不足、标准误差较大，且无法充分反映整个细菌群落的多样性。因此，在样本量和MAGs质量之间取得平衡至关重要。在本研究的后续部分中，所有结果和结论均基于完整性≥50%的MAG获得-该阈值为大多数研究中常用的标准。然而，关键结论对于高质量MAGs（完整性> 90%且污染<5%）仍然有效，详见补充文本S5，进一步增强了研究结果的可靠性。

我们进一步研究了溶原性MAGs在不同门中的分布情况。通过构建系统发育树对MAGs进行系统分类（图2a和图S5，表S2），我们观察到不同分类门之间溶原性MAGs的比例存在差异，这通过比值比（OR）得以揭示。溶原性MAGs占比最高的是硝化螺旋菌门（85.7%，OR：4.9，p = 0.003），其次是浮霉菌门（68.0%，OR：1.7，p = 0.028），两者均显著高于所有MAGs的平均值（55.0%）（表S5）。相比之下，某些门类（如髌骨细菌门）中的MAGs则呈现非溶原性倾向（38.8%，OR：0.5，p < 0.0001）（图2b，表S5）。考虑到MAGs的相对丰度，我们发现在芽单胞菌门（74.1%，OR：2.0，p < 0.0001）、硝化螺旋菌门（72.5%，OR：1.8，p < 0.0001）和绿弯菌门（71.3%，OR：1.7，p < 0.0001）中溶原性MAGs的普遍性显著较高（图2c，表S5）。

图2. 211个AS样本中溶原性MAGs的概述及其分类特征。（a）通过保守的细菌单拷贝标记基因和最大似然法，为随机选取的100个AS细菌MAGs子集构建了系统发育树。最外层环（紫色）和内层环（绿色）分别表示每个MAG的污染水平和基因组完整性。完整系统发育树（含所有细菌MAG）见补充图S5。基于（b）数量或（c）平均相对丰度计算溶原性MAGs在门水平的占比。绿色虚线代表溶原性MAGs占所有MAGs的比例。蓝色字体表示各门类MAGs总数。特定门类溶原性MAGs占比与全MAGs占比的比值比（OR）详见表S5，表示溶原性MAGs在不同门类中的分布情况。***、**和*分别表示p < 0.001、p < 0.01及p < 0.05。

我们对AS中溶原性百分比的估算表明溶原性在AS微生物群落中广泛存在（图1和图S6）。这种现象有四个潜在原因：（1）活性污泥是一个流通系统，溶原性感染增加了噬菌体在微生物聚集体内存活的可能性，而游离的噬菌体颗粒则被冲走。（2）在有利于高宿主细胞密度和生长速率的条件下，溶原性状态的优势已得到证实，这一现象由“背靠胜利者”模型所描述。AS系统为高生物密度提供了适宜的栖息地，因其富含满足多种微生物生长需求的营养物质。因此，AS系统的高生物密度可能是溶原性普遍存在的基础。（3）在营养丰富的环境中，由于细胞资源充足，与原噬菌体维持相关的适应性成本相对较低。这种降低的成本可能有助于微生物种群中溶原性的持续存在，特别是当原噬菌体为宿主提供额外的适应性优势时。（4）溶原性感染可以通过水平基因转移（HGT）改变宿主细胞表型并增强其适应性，使溶原菌在AS系统中获得竞争优势。与其他自然水生系统相比，AS是各种污染物的汇集地，微生物可能受到重金属、有机物及有毒物质等多重不利因素的影响。通过HGT获得关键基因的溶原菌能够更好地适应不利环境，这一机制可能同样适用于溶原菌占主导地位的污染环境，在那里经常发生水平基因转移现象，例如土壤环境。

通过大规模以基因组为中心的宏基因组学来估计AS中的溶原性百分比也可能受多重因素的限制。首先，尽管我们已谨慎选择了宏基因组数据，但不同研究之间的固有差异，包括污泥采样和处理方法、DNA提取方法、测序平台和深度的差异，将不可避免地引入一些偏差。其次，污水处理厂是复杂的工程系统，其多样化的配置、工艺设计和运行条件可能会显著影响溶原性噬菌体与宿主的相互作用。由于缺乏标准化和全面的元数据，本研究无法系统解释特定处理工艺对溶原性和原噬菌体诱导驱动机制。需要进一步研究以阐明特定运行参数，如工艺类型、水力停留时间、污泥停留时间和进水成分-如何影响活性污泥系统中的溶原性现象。

AS系统携带新型噬菌体并存在复杂的溶原性噬菌体-宿主相互作用

为了进一步研究溶原性MAGs中噬菌体的基因组特征，我们从1003个溶原性MAGs中鉴定了2509个噬菌体contigs，这些contigs可聚类成2499个独特的病毒操作分类单位（vOTUs）。在已鉴定的vOTUs中，有36个被鉴定为接近完整，其完整度水平大于90%（表S6）。所有vOTUs的平均大小为12 kb，其中大多数在5 kb至30 kb之间，约占总大小分布的94%（图S7）。本研究中vOTU的平均大小与之前在AS中的发现（15.2 kb）一致，但仅为GenBank数据库中dsDNA温和噬菌体的平均大小（44.2 kb）的近四分之一。虽然在营养丰富的环境中溶原性的整体适应性成本通常较低，但溶原性噬菌体及其宿主仍可能通过基因组精简化丢弃非必需基因，以进一步优化复制效率并最大限度地减少残余代谢负担。此外，宏基因组组装中的固有限制可能影响vOTU完整性，从而导致这种大小差异。综合这些因素可以解释在本研究中观察到的vOTU平均尺寸较小的现象。尽管部分MAGs含有>10个原噬菌体元件，但大多数仅含1-3个元件（图3a）。其原因可能是溶原性感染的保护属性，该机制能有效抑制宿主内的后续病毒感染。这种通过携带噬菌体实现的防御策略，其能量消耗应低于通过突变获得抗性的方式。噬菌体在宿主基因组中所占比例为0.04%-5.85%，平均值为0.4%（图3b），表明噬菌体通常仅占据宿主基因组的较小比例。

图3. AS中分离获得的MAGs中噬菌体的基因组特征与分类学多样性。直方图显示了（a）每个MAG中噬菌体数量的分布，以及（b）每个MAG中噬菌体基因组所占比例。（c）vOTUs的分类学归属。（d）网络图表示病毒簇（VC）与宿主的关联关系。灰色圆圈代表VCs，其他彩色圆圈代表宿主（MAG）在门水平的分类学分类。每条线条表示宿主被连接VCs感染的情况。灰色圆圈的大小代表病毒簇可感染的宿主数量。

基因共享网络揭示了AS系统中存在大量未分类噬菌体。所有vOTUs和参考序列大致在属水平上被聚类为827个病毒簇（VCs）（图S8和表S7）。与先前研究相似，只有极小比例（约1%）的AS样品中获得的vOTUs可以用NCBI RefSeq数据库中收录的已知噬菌体成功注释（图3c和表S7）。在已分类的vOTUs中，优势科被鉴定为Podoviridae（9个vOTUs）和Siphoviridae（9个vOTUs），其次是Myoviridae（7个vOTUs）和Autographiviridae（1个vOTU）（图3c和表S7）。低注释率可能主要归因于AS样本中缺乏完整病毒分离株基因组以及噬菌体数据库的不完整性。此外，噬菌体的序列完整性也会影响其注释结果。先前的一项研究通过从深度宏基因组测序数据（每个样本> 30 Gb）中鉴定病毒，使AS病毒组数据集在属和种水平上分别扩展了12倍和23倍。然而，缺乏专门的噬菌体数据库限制了注释的准确性。总体而言，发现AS系统承载各种各样的噬菌体，包括许多尚未表征的前噬菌体，这可能对工程系统的性能产生潜在影响。

我们发现系统发育上分散的噬菌体可以被相同的或系统发育上相关的MAGs携带，而聚类的噬菌体也可以感染跨越多个门的宿主MAGs，这表明AS中存在复杂的溶原性噬菌体-宿主相互作用网络。我们构建了噬菌体-MAGs网络来表示785个噬菌体（大致在属水平上聚为259个VCs）与498个宿主MAGs（跨越25个门）之间的相互作用（图3d），并发现28%的噬菌体簇（包含多个系统发育上相关的噬菌体）可以感染来自多个门的宿主MAGs。在跨越9个门的MAGs中，发现了两个分别包含28个和29个未分类的系统发育相关的噬菌体的噬菌体簇（表S8）。此外，相同的MAG可能携带系统发育上分散的噬菌体。在噬菌体-MAG网络中，只有46个携带噬菌体的MAG可以在所有MAG中聚类。我们的结果与先前的研究结果相似，揭示某些噬菌体可感染来自更高分类单元的多种宿主。这些结果挑战了传统的噬菌体宿主范围狭窄的观点。噬菌体宿主范围狭窄的观点主要来自于依赖于培养的研究，这类研究因可培养的微生物物种及其相关噬菌体的多样性有限而存在固有偏见。这种限制可能导致对噬菌体-宿主相互作用的真实广度的低估。然而，最近在培养依赖和培养独立方法上的进展都揭示了存在广泛宿主范围的噬菌体，其感染能力可跨越多个分类群，甚至跨越不同门类。例如，在AS或深海中的病毒甚至可以感染来自不同域的宿主（细菌和古菌）。这些发现表明，广宿主范围的噬菌体在自然环境中的分布可能比以前认识到的更广泛。最终，这些结果强调了具有广泛宿主范围的噬菌体在自然界中的广泛分布，以及它们在促进宿主之间的基因交流中的潜在作用。

溶原性噬菌体的活性状态与其功能性微生物密切相关

在表征溶原性MAGs及其携带的噬菌体的流行性后，我们进一步测试了噬菌体在AS中的活性和可诱导性，这是溶原性噬菌体-宿主相互作用的关键环节。结果显示，通过测定噬菌体与宿主读取覆盖率比值及相应效应大小，发现AS样本中绝大多数（69.8%）的噬菌体具有潜在活性（图4a），且分布在所有观察到的溶原菌门中，该结果与小鼠肠道微生物群研究（69.6%）的结果一致。结果显示，宿主种群可能正在经历噬菌体诱导，由此产生的裂解事件对重塑细菌群落结构具有不可忽视的影响。我们还发现在MAG数据集中鉴定出的噬菌体中，有31.7%的噬菌体可以与其他研究中收集的AS样本中游离的病毒组序列（PRJNA 639411）很好地比对（图4a），表明这些噬菌体经过诱导并形成游离病毒颗粒，进一步证实了其可诱导性。通过计算方法（PrpagAtE）与其他污水处理厂病毒组分析（图S9），共鉴定出590个活性噬菌体，表明两种方法结合使用可对潜在活性进行合理准确的预测。

图4. 溶原性噬菌体的活性及其与功能性微生物的关系。（a）通过PropagAtE软件对活性噬菌体的比例进行了计算预测，并分别利用其他活性污泥样本的病毒组数据进行了验证。（b）细胞经丝裂霉素C（MMC）诱导噬菌体后发生裂解，释放出病毒样颗粒，并在诱导后48小时进行定量检测。CK代表对照组处理。每个箱形图表示四分位距，其中中线代表中位数。***表示p < 0.001（Wilcoxon符号秩检验）。（c）曼哈顿图显示，经MMC诱导后溶原性MAGs的分类学信息减少。虚线代表显著性阈值（p = 0.05）。圆圈大小代表相对丰度的下降百分比。（d）CK组与MMC处理组间磷酸盐浓度的差异。噬菌体在污水处理厂中裂解与（e）有机污染物及（f）营养物质(氮、磷)去除相关功能微生物的潜在能力。圆圈大小代表每个国家所有样本中易受活性溶原性噬菌体裂解的功能微生物丰度（RPKM）之和。PAO：磷酸盐富集微生物；NOB：亚硝酸盐氧化细菌；AOB：氨氧化细菌；Anammox：厌氧氨氧化。

此外，我们进行了诱导实验，并观察到由MMC诱导的AS中病毒样颗粒显着增加（p < 0.05）（图4b和图S10），证实了AS中噬菌体的诱导作用。选择MMC作为广泛使用且标准化的化学诱导剂，旨在受控的实验室条件下验证可诱导原噬菌体的存在。尽管该方法并非天然存在于环境中，但它为跨样本评估噬菌体活化潜力提供了一种可靠的方法。为了确定哪些溶原菌和噬菌体被诱导，我们在MMC诱导前后对细菌和病毒组分进行了测序。我们从诱导实验的数据集中共鉴定出了215个溶原性MAGs。诱导后溶原性MAGs的总丰度下降了28.3%。其中59个MAGs呈显著下降趋势（p < 0.05），表明至少27.4%的溶原性MAGs被诱导（图4c）。这59个MAGs主要归类于拟杆菌门（16个MAGs）、绿弯菌门（15个MAGs）、变形菌门（12个MAGs）和酸杆菌门（9个MAGs）。功能基因注释显示，诱导产生的溶原菌包括phosphate-accumulating bacteria Ca. Accumulibacter、nitrate-reducing bacteria unclassified Burkholderiaceae (MAG AS_MMC_bin16) 、unclassified Xanthobacteraceae (MAG AS_MMC_bin52)、nitrite-reducing bacteria Azonexus、Bradyrhizobium和Skermania。此外，与对照组相比，MMC处理组的磷酸盐去除率显著降低（p < 0.05）（图4d），这与诱导裂解导致的Ca. Accumulibacter丰度显著下降相一致。这些结果表明，MMC可以诱导AS系统中具有营养物去除功能的微生物。此外，从游离的病毒组的clean reads映射到溶原性MAGs中的噬菌体的clean reads后发现，59个诱导型MAG携带的噬菌体中有23.9%在诱导后相对丰度显著增加。

为了深入研究污水处理厂中活性噬菌体与功能微生物之间的联系，我们根据MiDAS数据库中的功能基因和分类信息，对已鉴定宿主属的代谢功能进行了分析。活性噬菌体和宿主之间的联系已在若干负责有机污染物降解的好氧异养细菌中确立（图4 e）。在至少四个国家跨16个属中观察到活性噬菌体-宿主相互作用。值得注意的是，除Thauera、Pseudomonas和Giesbergeria属外，其余所有属都被至少两种活跃的噬菌体感染。这些发现表明活性噬菌体可能对WWTP中有机污染物的去除具有间接影响的潜力。在活性噬菌体-宿主相互作用中，Zoogloea通常参与絮凝体形成并引发污泥膨胀事件。Zoogloea与其相应的活性噬菌体之间的关联可以帮助未来设计解决污泥发泡问题的噬菌体诱导策略提供依据。

活性噬菌体还可以影响参与AS中营养代谢过程（N、P）的细菌群落，这体现在活性噬菌体与其宿主之间存在着13个已知参与营养转化的细菌属的关联（图4f）。这些细菌包括一种磷酸盐富集微生物（PAOs）属、一种氨氧化细菌（AOB）属、一种厌氧氨氧化细菌（Anammox）属、一种亚硝酸盐氧化细菌（NOB）属以及NOB/完全氨氧化菌（Comammox）硝化螺旋菌。在多个国家的污水处理厂中已经确定了关键的氮和磷去除溶原菌，如亚硝化单胞菌属、硝化螺旋菌属和Candidatus Accumulibacter（表S9），突出了它们在污染物去除中的关键作用。值得注意的是，功能性微生物可以被多种活性噬菌体感染。例如研究发现Ca. Accumulibacter携带1-5个活性噬菌体，所有5个组装的Ca. Accumulibacter MAG都含有噬菌体（表S2）。这与近期研究结果一直，该研究在43个分析的Ca. Accumulibacter基因组中均检测到噬菌体，表明该属细菌具有较高的溶原性易感性。先前研究表明，废水中的常见物质（如铜、氰化物和环丙沙星）诱导Ca. Accumulibacter中的噬菌体激活，会降低增强型生物除磷反应器中的除磷效率，强调了噬菌体诱导裂解可能破坏全规模处理厂中的磷循环的风险。我们的实验结果进一步证实了这种风险。MMC处理诱导了Ca. Accumulibacter的裂解，导致AS系统中磷酸盐去除效率显著降低（图4c和4d）。虽然观察到关键类群和营养物去除的减少，但其潜在机制（如基因表达或代谢变化）仍不清楚。未来的研究使用宏转录组学或非靶向代谢组学将有助于揭示噬菌体激活如何影响微生物功能和处理性能。

除了Ca. Accumulibacter，我们的研究结果表明硝化螺旋菌属，一个对亚硝酸盐氧化和完全氨氧化至关重要的属，也表现出高溶原性易感性。本研究组装的24个硝化螺旋菌属MAGs中有20个含有噬菌体（表S2），其中部分菌株甚至携带多达15个活性噬菌体。在多形亚硝化螺菌25196中，已证实六价铬、氰化钾、温度变化及pH应激等可诱导原噬菌体激活，这可以解释全规模系统中氨氧化过程频繁中断的现象。此外，废水中常见的环境应激因子，包括邻苯二甲酸丁苄酯和过氧化氢等氧化剂，也被证实与噬菌体活化有关，威胁厌氧消化过程和相关营养物去除的稳定性。这些发现强调了废水处理过程中各种常见的环境应激因子，包括pH值变化、重金属和特定有毒化学物质，均有可能诱导废水处理中各种关键功能微生物的噬菌体活化。

此外，为了补充我们对原噬菌体动力学的理解，我们分析了来自一个具有代表性的全规模污水处理厂的两年期每月宏基因组样品序列（WWTP 7;表S1）。30个最丰富的vOTUs（噬菌体）呈现出季节性丰度变化模式，而Bray-Curtis相似性分析揭示了随时间推移的周期性振荡与渐进性组成漂移（图S11及S12）。在采样期间，水质的理化性质保持相对稳定（图S13），且未记录重大运行扰动。这些发现表明，所观察到的噬菌体波动可能反映了内在的生态节律，而不是直接的外部诱因。然而，缺乏高分辨率操作元数据限制了我们将噬菌体动态与特定工艺条件或压力事件联系起来的能力。未来的研究应该整合纵向宏基因组监测与详细的运行记录（例如化学品使用、流量变化、事故报告），以发现潜在的噬菌体激活预警指标。这种综合方法对于开发实时监测框架和设计有效的干预策略以维持全规模污水处理厂的稳定性能至关重要。

这些发现共同表明，在AS系统中参与碳、氮和磷循环的微生物群落中，噬菌体具有活性且可诱导的性质。虽然AS系统通常具有较强的抗干扰能力，但识别可能触发噬菌体诱导的环境压力对于理解处理效率受损的潜力至关重要，以及在极端情况下系统性能崩溃的可能性。未来的研究应致力于阐明在现实污水治理环境中可能激活这些噬菌体的具体条件。

结论

通过大规模以基因组为中心的宏基因组学研究和实验验证表明，活性污泥系统中溶原性噬菌体-宿主相互作用的普遍性，强调了噬菌体在塑造微生物群落和影响有机物和营养物去除效率方面的关键作用。通过从宏基因组数据重建的基因组，我们深化了对溶原性细菌与其宿主之间的相互作用的认知，并揭示了AS系统中噬菌体多样性的全新维度。对溶原性感染及其功能细菌影响的理解，可能会深化我们对这些微生物群落内在机制的认识，并促进AS群落的长期稳定维持。这些研究结果表明，溶原性可能是影响AS系统性能的生态相关因素，因此在未来污水处理厂设计和运行的研究中值得关注。未来的研究需要评估在何种条件下，噬菌体可能引发功能微生物的裂解，并可能导致AS系统的崩溃。此外，溶原性感染或诱导在应对其他工程挑战（如控制AS系统中有害微生物暴发）中的潜在应用价值，亦值得进一步探索。