Nature Microbiology | 一种基于生成式人工智能的抗多重耐药细菌抗菌肽的发现方法

摘要 

迫切需要发现针对临床“超级细菌”的新型抗菌肽（AMPs），以应对持续加剧的抗生素耐药危机。由于具有广谱活性、快速杀菌机制以及相比传统抗生素更低的诱导耐药风险，AMPs 被认为是极具潜力的候选抗菌药物。本研究建立了一个经过预训练的蛋白质大语言模型（LLM）——ProteoGPT，并进一步开发了多个专用的子语言模型（subLLMs），构建了一个多步骤的序列化筛选流程。该流程能够在数亿条肽序列中进行快速筛查，既确保其具有强效抗菌活性，又最大程度降低细胞毒性风险。通过迁移学习，我们为这些语言模型赋予了不同领域的专业知识，从而在统一的方法学框架下实现了AMPs的高通量挖掘与生成。值得注意的是，无论是挖掘到的AMPs还是模型生成的AMPs，在体外均对来自重症监护病房（ICU）的碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌（CRAB）和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）表现出较低的耐药发展风险。此外，这些AMPs在小鼠大腿感染模型中的治疗效果与临床使用的抗生素相当甚至更好，同时不会造成器官损伤或扰乱肠道微生物群。其作用机制包括破坏细胞质膜和诱导膜去极化。总体而言，本研究提出了一种基于生成式人工智能的抗菌新药发现策略，为应对多重耐药菌感染提供了一种高效且大规模探索抗菌肽空间的新途径。

世界卫生组织（WHO）已公布了一份多重耐药细菌名单，统称为“ESKAPE”菌群，其中最需要优先应对的是碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌（CRAB）。碳青霉烯类抗生素是当所有其他选择失败时的"最后手段"治疗，非常容易出现和传播抗菌药物耐药性(AMR)，鉴于这一紧迫问题，抗菌肽（AMPs）因其耐药性发展速度相对较慢，被认为是传统抗生素的有前景替代方案。 大型语言模型（LLMs）近年来在自然语言理解方面展现出颠覆性潜力，是向通用人工智能迈出的重要一步。LLMs通常基于Transformer架构，拥有数亿甚至数十亿可训练参数，并在海量文本语料上进行训练。然而，现有的通用LLMs在处理分子、蛋白质和基因等科学数据时往往力不从心。为更好地理解科学语言，专门开发了面向科学领域的LLMs，并针对不同的学科和研究领域进行了定制化设计。 在本研究中，我们通过迁移学习建立并应用了多个LLMs，实现了抗菌肽的高通量挖掘与生成，并在体外和体内验证了其对临床超级细菌（特别是CRAB和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA）的抗菌效果。令人鼓舞的是，无论是挖掘得到的AMPs还是模型生成的AMPs，其抗菌效果均与临床抗生素相当甚至更优，且具备额外的抗炎作用，同时没有观察到其对器官损伤或造成肠道稳态失衡。此外，这些AMPs在临床超级细菌的耐药性发展方面表现出更低的易感性，这是新药开发过程中的一个重要方面。综上所述，我们基于LLMs构建的框架能够通过数据挖掘与文本生成策略，实现高通量筛选与发现高效且安全的抗菌肽，为开发应对临床超级细菌感染的下一代抗生素提供了有力工具。

结果

ProteoGPT的开发：一个预训练的大语言模型 

在迁移学习中，一种非常高效的策略是通过精心设计的自监督任务，在海量的无标签数据上对模型进行预训练。为了使模型能够专门用于抗菌肽（AMPs）的挖掘与生成，我们构建了一个多功能的预训练模型——ProteoGPT，这是一个拥有超过1.24亿参数的大语言模型（LLM），其训练过程基于蛋白质序列空间的知识迁移（图1a）。 我们从UniProtKB/Swiss-Prot数据库中获取了609,216条无冗余的标准和异构体蛋白质序列，其中96%的序列长度不超过1000个氨基酸（AAs），另有1,296条序列长度超过3000个氨基酸（图1b）。这些蛋白质来源广泛，涵盖人类、动物、植物、微生物等多种生物（图1c）。在预训练过程中，所有蛋白质序列首先被划分为多个数据片段，然后输入ProteoGPT，依次由其功能模块进行处理（图1a）。经过训练后，我们保留了稳定的预训练模型，以便未来在更具体的下游任务中进行微调（图1d）。与其他蛋白质大语言模型（Protein-LLMs）相比，ProteoGPT 的一个关键特点在于其训练数据基础的高质量。ProteoGPT 使用的是高质量、经过人工注释和严格整理的Swiss-Prot数据库，而非未经筛选的蛋白质序列数据。这一高质量的来源使ProteoGPT拥有更准确、更可靠的数据基础，为后续功能肽相关的下游任务提供了生物学上更合理的预训练模板。 迁移学习模型的开发 在完成ProteoGPT的预训练后，我们进一步进行了迁移学习，以提升其在抗菌肽（AMP）文本分类与生成任务中的能力。通过在不同数据集上微调ProteoGPT，我们构建了三个迁移子语言模型（subLLMs）：AMPSorter、BioToxiPept和AMPGenix。 AMPSorter 是一个用于识别抗菌肽的分类器，通过在包含AMP和非AMP的双类数据集上对ProteoGPT进行微调而构建（图2a）。在整个训练过程中，AMPSorter 表现出高度的鲁棒性，未出现欠拟合或过拟合迹象，其训练集与验证集的损失曲线和准确率曲线在各个epoch中保持一致。在测试集上，AMPSorter在整体分类性能方面表现优异（AUC=0.99），并能准确识别所有真实的AMPs，显著降低漏检率，避免遗漏大量真阳性（AUPRC=0.99）。 在训练和预测过程中，AMPSorter 能灵活处理含有非天然氨基酸（UAAs）的序列，包括d型氨基酸（如r）、未知或任意氨基酸（X）、非标准氨基酸（如吡咯赖氨酸O、硒半胱氨酸U）以及非特异性表示（如B、Z）。在包含194条UAAs序列的测试集中，AMPSorter 在这些序列上实现了96.43%的预测精度，几乎完美地区分了正样本与负样本。

 

图1 a，ProteoGPT的结构示意图。
ProteoGPT由多个Transformer模块顺序堆叠组成，并分为三个主要功能模块：输入模块、处理模块和输出模块。输入模块由嵌入层（embedding layers）构成，用于将编码后的序列数据映射到连续向量空间，从而帮助模型理解序列信息。同时，引入位置编码（positional encoding）以提供序列的位置信息。

处理模块由多头自注意力层（multi-head self-attention layers）和前馈神经网络层（feed-forward neural network layers）组成，其主要功能是对来自输入模块的向量进行非线性变换，使模型能够聚焦于序列的不同片段，并建立上下文理解。每个处理模块均包含残差连接（residual connection）和层归一化（layer normalization），以确保梯度的稳定传播并促进模型训练稳定性。

输出模块主要由线性层（linear layers）组成，用于生成下一个token的概率分布。

b，a中使用的蛋白质序列长度分布。

c，a中使用的蛋白质序列来源分布。

d，ProteoGPT 的训练过程。蓝色实线表示原始损失值，黑色实线表示平滑后的损失值。

a中的示意图使用 BioRender.com 绘制。

为增强模型的泛化能力并避免因序列相似性引发的潜在过拟合，我们采用CD-HIT聚类方法，对测试集中与训练集和验证集相似度大于70%的序列及含UAAs的序列进行了过滤，从而构建了更为严格的基准测试集（725条AMP序列和1071条非AMP序列），用于与现有AMP分类算法进行比较。经过CD-HIT处理后，训练集、验证集与基准测试集之间的重叠显著减少，Fréchet ChemNet距离（FCD）由7.92上升至28.16，表明基准集与训练/验证集在分布上存在明显差异。该方法旨在考察模型在处理相似性较低的新型序列时的能力，从而模拟真实应用场景中AMPs可能与已知序列不完全匹配的情况。在同一基准测试集上的全面评估结果显示，AMPSorter 的AUC达0.97，AUPRC达0.96，优于所有现有模型，包括AMPlifyimbal和Macrel（图2b、2c）。此外，AMPSorter实现了90.67%的精确率、88.89%的F1得分以及81.66%的Matthews相关系数（MCC）。这些结果表明，AMPSorter具备出色的能力来准确区分AMP与非AMP序列。更进一步，与其他模型相比，AMPSorter在特异性（93.93%）和敏感性（87.17%）之间保持了较高的平衡，说明其不仅能够在初筛阶段有效捕捉潜在的AMP序列，还能显著减少假阳性。此外，在一个完全独立的外部验证数据集上，AMPSorter预测精度达到93.99%，进一步验证了模型的稳健性与可靠性。BioToxiPept是一个用于识别肽类细胞毒性的分类器，其模型架构与AMPSorter相同（图2a）。在微调阶段，BioToxiPept通过包含有毒与无毒短肽的数据集进行了再训练和精调。与AMPSorter类似，BioToxiPept在训练过程中同样表现出良好的拟合性，没有出现欠拟合或过拟合迹象。在相同测试集上的分类性能评估中，BioToxiPept 的整体表现与 ToxIBTL 和 ToxinPred2.0-RF 相当（图2d）。值得注意的是，精确率–召回率（PR）曲线显示，BioToxiPept与 ToxIBTL 在识别真正有毒肽方面的能力优于其他模型（图2e，AUPRC = 0.92）。这种更高的识别能力显著降低了假阴性率，从而有效减少了后续实验验证所需的成本与工作量。

图2 面向AMPs具体任务的迁移学习模型开发

a，基于ProteoGPT的迁移学习模型概述。AMPSorter用于识别抗菌肽（AMPs）；BioToxiPept用于预测多肽的毒性。由于ProteoGPT主要作为生成模型，因此在其基础上额外增加了一个分类模块，用于执行AMP或毒性识别任务。该分类模块由分类头（classification head）和输出层组成：分类头包含一个层归一化（layer normalization），用于接收ProteoGPT最后一个Transformer模块的输出表示，并在模型输出前进行归一化处理；输出层则为softmax层，将ProteoGPT输出的特征映射到最终的分类标签空间，从而获得每一类别的概率分数。AMPGenix用于生成类似AMPs的短肽序列。其主要参数包括：temperature（温度）：控制序列生成的随机性；prefix（前缀）：序列起始的token或氨基酸；n_tokens：生成的token数量；n_samples：在给定前缀和n_tokens设置下生成的序列数目。b,c，AMP识别中，不同分类模型在基准数据集上的AUC（b）和AUPRC（c）表现。d,e，细胞毒性识别中，不同分类模型在同一测试集上的AUC（d）和AUPRC（e）表现。f，使用6个高性能AMP分类模型，对比预训练模型（ProteoGPT）和迁移子模型（AMPGenix）在不同温度参数（0.5、1、2和3）下生成的序列阳性预测率。g，使用相同的6个高性能AMP分类模型，对比5个外部无约束AMP生成模型与AMPGenix在不同温度参数（0.5、1、2和3）下生成的序列阳性预测率。

不考虑结构的情况下，短肽可被视为由20种天然氨基酸(AAs，类似“字母”)进行排列组合而成，这些组合可形成具有特定功能的功能域(类似“单词”)，从而携带特定的功能信息(“意义”)。AMPGenix是一个在ProteoGPT基础上重训练的无约束序列生成器，其训练数据集由已知AMP序列构成(图2a)。在再训练过程中，我们对ProteoGPT底层权重进行了微调，从而构建了一个稳定的AMPGenix模型，并在损失值最小化的状态下，具备了生成潜在AMP序列的能力。AMPGenix 能够在无约束条件下，根据设定的token数量和前缀信息(即首个氨基酸)生成指定数量的肽序列。我们对已收集AMPs的首个氨基酸分布频率进行了统计分析，结果显示：甘氨酸(G)、赖氨酸(K)、苯丙氨酸(F)、精氨酸(R)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、丝氨酸(S)和色氨酸(W)最为常见，每种的出现次数均超过400次。这些高频氨基酸被用作前缀信息，在不同温度(0.5、1、2、3)下进行文本生成。温度参数用于调控模型输出的随机性与多样性。在token长度为8–15的条件下，我们针对每个前缀和token数量生成了100条序列，每个温度设定共生成8,000条序列。随着温度的升高，模型输出的随机性显著增强(序列唯一性从0.81升至1)，生成的序列类型更加多样。对于仅包含天然氨基酸的序列，较高温度进一步提升了序列的多样性(多样性指数从0.97升至0.99)，并提高了生成不同类型序列的概率。新颖性(novelty)在四个温度条件下保持相对稳定，表明序列新颖性已趋于饱和。此外，温度升高时，生成序列与真实AMP的特征分布更加接近(FCD从13.61降低至9.26和9.56)(扩展数据表2)。我们进一步使用6个高性能AMP分类模型对这些生成序列进行评估，结果表明，在所有温度设定和分类模型中，AMPGenix生成的序列均明显优于ProteoGPT生成的序列，其被分类为AMP的比例显著更高(图2f)。这一结果凸显了通过迁移学习进行领域特异性微调的有效性，使AMPGenix具备了更强的捕捉AMP关键特征的能力。在对比实验中，我们对序列前缀、数量和长度等条件进行了标准化处理(方法详见Methods)，并将AMPGenix与5个外部无约束AMP生成模型(HydrAMP、Basic、PepCVAE、AMP-GAN 和 AMP-LM)进行了性能比较。研究结果表明，AMPGenix生成的序列在六个分类模型中的抗菌肽(AMP)识别率更高(图 2g)，突出了其在捕捉AMP特征方面的精确性。此外，与其他所有模型相比，AMPGenix 生成的序列具有更低的FCD值，这表明AMPGenix在保持多样性的同时，生成的序列与真实AMP分布特征的相似度更高。然而，我们观察到，尽管较高温度下多样性的增加使得生成的序列更接近真实分布的整体特征，但其分类阳性率略有下降(图 2g)。这主要是因为序列的唯一性和多样性增强，导致某些特征发生偏移，使分类器更难准确匹配这些序列的特征。这一现象揭示了生成模型中多样性与有效分类之间存在内在的权衡关系。此外，AMPGenix 还能生成少量含有非天然氨基酸(UAA)的短肽，其中超过70%的序列被AMPSorter识别为 AMP。这种能力赋予AMPGenix更高的灵活性与创造潜力，为AMP设计提供了更广阔的空间。

抗菌肽(AMPs)的高通量挖掘与生成结合迁移子模型，我们提出了一个由LLMs组成的顺序管道框架——SPEL(Sequential Pipeline Ensembled by LLMs)，它结合了了AMPSorter、BioToxiPept及实验室验证(图3b)。在本研究中，我们设计了两种用于发现新型AMP的高通量策略：(1)数据挖掘(m_AMPs)：从完整的UniProtKB/Swiss-Prot数据库中识别潜在AMP(图3a)；(2)文本生成(g_AMPs)：使用AMPGenix直接生成非天然AMP序列(图3c)。通过滑动窗口技术，我们将609,216条无冗余标准序列和异构体序列切分为长度为8–30个氨基酸的短肽(图3a)。最终组装出多个无冗余短肽数据集(NRSPDs)，共计410,192,277条肽序列，可用于全面的数据挖掘。利用SPEL，我们共识别出121,405,811条肽候选序列(m_AMPs)，其中82,694,928条被判定为非细胞毒性(m_AMPs_nontox)，构成数据挖掘的候选库，用于后续不同类型AMP的筛选。使用AMPGenix(温度参数设为默认值1)生成了7,798条独特肽序列，形成生成的无冗余短肽数据集(GNRSPDs)，其中76.1%的序列被识别为AMPs(g_AMPs)。经过BioToxiPept筛选后，4,736条标记为非毒性的序列构成文本生成的候选库(g_AMPs_nontox，扩展数据表4)。为了独立评估语言模型的有效性，我们从基于文本生成的候选库中选择了20条AMPSorter预测概率最高的序列(PT系列，PT-1–PT-20)，进行了体外抗菌活性初步测试。用于最小抑菌浓度(MIC)测定的菌株包括抗生素敏感菌(大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923)、临床分离超级细菌(CRAB与MRSA菌株)以及白色念珠菌ATCC10231。初步测试结果显示，20条肽中有90%(18/20)对至少一种菌株表现出抑制活性(MIC ≤ 512 μg/ml)，其中12条肽的MIC值 ≤ 256 μg/ml(扩展数据表5)。值得注意的是，PT-1、PT-4、PT-12、PT-15、PT-18和PT-20在抗生素敏感菌株、耐药菌株及真菌病原体中表现出明显的广谱抗菌活性，最低MIC值可达1 μg/ml。其中，PT-1、PT-4、PT-15、PT-18和PT-20针对三株CRAB菌株的MIC为2~21.3 μg/ml；PT-1和PT-18针对两株MRSA菌株的MIC为4~13.3 μg/ml；五条肽(PT-1、PT-4、PT-12、PT-15、PT-18)对白色念珠菌ATCC10231的MIC为8~32 μg/ml。同时观察到菌株特异性差异，例如PT-3对CRAB菌株具有强效活性，而PT-8则选择性作用于MRSA菌株。总体而言，这些结果凸显了AMPSorter在识别AMP序列进行实验验证方面的能力，并验证了AMPGenix在生成功能性AMP候选库的潜力，尤其适用于应对临床耐药病原体。将AMPSorter的阈值设定为0.9后，候选库中的m_AMPs和g_AMPs数量分别减少至26,322,225条(占6.4%)和3,069条(占39.4%)(扩展数据表3和4)。为了在比较两种策略的效率时建立明确的阈值并确保肽类型的一致性(即阳离子抗菌肽)，我们引入了一种抗菌活性的定量构效关系(QSAR)分析算法。这种方法在比较过程中起到“门控”作用，确保两种策略满足相同的筛选标准，并有助于选取适当数量的肽用于实验验证。当相对评分(RS)阈值设为0.88时，共筛选出154条m_AMPs(8–12个氨基酸；图3d和扩展数据表3)和42条g_AMPs(11–26个氨基酸)进入实验验证。与m_AMPs相比，g_AMPs表现出显著更高的预测抗菌活性(图3f、g)以及更低的预测细胞毒性(图3h)，这间接证明了AMPGenix在学习AMP特征方面的优势。相较于四个公共AMP数据库中已知AMPs(APD3、DBAASP、DRAMP和CAMP)(扩展数据图2a)，这196条入选肽在氨基酸组成上显示出F(苯丙氨酸)、I(异亮氨酸)、L(亮氨酸)、R(精氨酸)和W(色氨酸)的高频富集。结果表明，g_AMPs与已知AMPs的FCD值明显高于m_AMPs与已知AMPs的FCD值，说明g_AMPs相较m_AMPs与已知序列的差异更大。此外，对序列空间的UMAP(统一流形近似与投影)可视化显示：m_AMPs倾向于形成更紧密的聚类，其分布与已知AMPs高度接近；而g_AMPs则表现出更为分散的分布特征(图3i)。这种差异可能是因为m_AMPs与大多数已知AMPs均来源于天然蛋白，其序列通常遵循保守的模式，从而具有较高的序列相似性。进一步的EggNOG mapper分析结果显示，这154条m_AMPs主要嵌入于参与信息存储与处理、细胞过程及信号传导的蛋白中。因此，这些“加密AMP”可能受到功能性约束，例如必须保留特定的保守区域，以确保其在抗菌或免疫调控过程中发挥有效作用。相比之下，g_AMPs是在AMPGenix基于短肽的先验知识下生成的，具有更大的序列灵活性，因此在序列空间中呈现出更为广泛的分布。

图 3  AMP筛选方法概览

a，NRSPD集合。滑动窗口的窗口大小设为L，步长为L/2，其中L的范围为8–30。通过对完整的UniProtKB/Swiss-Prot数据库采用滑动窗口技术，共构建了5个NRSPD，涵盖410,192,277条短肽序列。

b，SPEL整体流程。整个SPEL流程包括AMPSorter、BioToxiPept和湿实验验证模块。输出的候选肽序列的抗菌活性通过湿实验进行验证。

c，GNRSPD集合。使用AMPGenix在默认温度参数=1下生成的序列，构建了10个不同的GNRSPD集合，总计包含7,798条独特短肽序列。

d、e，154条m_AMPs(d)和42条g_AMPs(e)的长度分布。

f–h，154条m_AMPs与42条g_AMPs的AMPSorter预测概率(f)、基于QSAR的相对评分RS(g)以及BioToxiPept预测概率(h)。箱线图的中线表示中位数，上下边界分别对应第25和第75百分位数，须线延伸至1.5倍四分位距范围内的最远点。使用双侧Mann–Whitney U检验进行比较，确切的P值见原始数据图3。

i，使用k-mer编码(k = 3)的AMPs、m_AMPs和g_AMPs的UMAP可视化。每个点代表一个肽序列，其位置通过将高维的k-mer特征空间降维至二维来确定。b中的示意图由BioRender.com绘制。

体外功能性AMPs的活性评估

湿实验的整体工作流程如扩展数据图3所示。共合成并在体外表征了154条m_AMPs和42条g_AMPs。首先，采用Kirby–Bauer disk diffusion assay(纸片扩散法)，在128 μg肽浓度下检测其对Escherichia coli ATCC25922和Staphylococcus aureus ATCC25923的抗菌活性。结果显示，75.97%(117/154)的m_AMPs和61.91%(26/42)的g_AMPs表现出潜在的抑菌能力(图4a)。随后，53.89%(83/154)的m_AMPs和40.48%(17/42)的g_AMPs被进一步筛选，这些肽在至少一种细菌上表现出抑菌圈直径≥10 mm。进一步在64 μg浓度下进行的纸片扩散试验表明，66.27%(55/83)的m_AMPs和100%(17/17)的g_AMPs对E. coli具有显著抗菌活性，而55.42%(46/83)的m_AMPs和82.3%(14/17)的g_AMPs对S. aureus也表现出较强的抑菌能力。最终，共有44条m_AMPs和14条g_AMPs在E. coli或S. aureus上抑菌圈直径≥10 mm，被选用于进一步测试。

最小抑菌浓度(MIC)试验在1×108c.f.u./ml的高接种量条件下进行。结果显示，有11条m_AMPs和17条m_AMPs在对E. coli和S. aureus的MIC值≤160 μg ml^−1(图4b)。在所筛选的g_AMPs中，有14种对Escherichia coli表现出抗菌活性，12种对Staphylococcus aureus有效，其最低抑菌浓度(MIC)均不高于160 μg/ml，其中有8种对S. aureus的MIC达到≤0.625 μg/ml。结合溶血率(<8%)的结果，我们进一步筛选出10种最具活性的m_AMPs和10种最具活性的g_AMPs，用于评估其对人胚肾细胞(HEK293)的细胞毒性。结果显示，这20 种AMPs中有19 种几乎无细胞毒性，细胞存活率≥50%(如图4c所示)。随后，我们在标准接种量(105c.f.u.s/ml)下，测定了它们对药物敏感株和耐药株的MIC值(图4d,e)。其中5种具有广谱抗菌活性的AMPs(g_AMP14、g_AMP41、g_AMP42、m_AMP46和m_AMP76)对所有细菌的MIC值均低于32μg/ml。

其中，m_AMP76的抗菌活性最强，对carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii QLH-2022-637的MIC值为4 μg/ml；g_AMP41对methicillin-resistant Staphylococcus aureus QLH-2022-718的MIC值为8μg/ml。此外，g_AMP33对革兰氏阴性菌(如E.coli和CRAB)具有明显的抑制作用，而g_AMP35对MRSA的抑制效果明显强于对CRAB的抑制。值得注意的是，这7种AMPs均对Candida albicans表现出较强的抑制作用，其MIC范围为 16-64 μg/ml。基于这些体外实验结果，我们最终选择这7种具有代表性的 AMPs 进入后续的体内实验研究。

 

图 4 体外评估抗菌肽(AMPs)的抗菌效果与生物学特性。
a，依据抑菌圈直径统计AMPs对Escherichia coli和Staphylococcus aureus的抑菌作用比例。每个柱状图上方标注的数字表示对应AMPs的数量。
b，44种m_AMPs和14种g_AMPs在高接种量(108c.f.u.s/ml)下对E. coli和S. aureus的抗菌活性水平。
c，前20种候选AMPs的细胞毒性与溶血率。
d、e，前20种候选AMPs在标准接种量(105c.f.u.s/ml)下，对E. coli、S. aureus、carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii(CRAB)、methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA)及Candida albicans的最小抑菌浓度(MIC)分布(d)及对应MIC(e)。

图中标有“#”的AMPs为进入体内实验筛选的7种领先候选肽。
CRAB 267，CRAB QLH-2022-267；CRAB 636，CRAB QLH-2022-636；CRAB 637，CRAB QLH-2022-637；MRSA 266，MRSA QLH-2022-266；MRSA 718，MRSA QLH-2022-718。

小鼠体内感染模型中的治疗效果评估我们建立了小鼠大腿感染模型(图5a)，以评估7种抗菌肽(AMPs)在治疗carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii(CRAB QLH-2022-637)或methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA QLH-2022-718)感染中的疗效。如图5b所示，5个AMP处理组(g_AMP14、g_AMP33、g_AMP42、m_AMP46 和 m_AMP76)相比无菌水处理组，CRAB在大腿组织中的回收量显著减少约70%。其中，g_AMP42和m_AMP76的清除率分别达到83%和87%，与polymyxin B组的86%相当。对于MRSA感染，大腿组织中的菌落数在4个AMP处理组(g_AMP14、g_AMP35、m_AMP46和m_AMP76)减少约70%，其中g_AMP14的清除率达到85%，而vancomycin组的清除率为89%(图5c)。尽管g_AMP41和g_AMP42在体外对CRAB和MRSA均表现出较强活性，但在体内未能有效清除病原体。为探究这一差异，我们进行了蛋白水解降解耐受性实验(图5d)。结果表明，g_AMP41和g_AMP42的最终浓度低于60%，而g_AMP14、g_AMP33、g_AMP35、m_AMP46和m_AMP76在血清蛋白酶连续作用4小时后仍保留高达80%的初始浓度(图5e)。与水和抗生素处理组相比，AMP治疗组(表现出显著治疗效果)的肠道细菌群落组成在门、纲和属水平上未出现明显紊乱。此外，AMP治疗组的Firmicutes/Bacteroidetes ratio(F/B比值)，这一广泛被认为对维持肠道稳态具有重要作用的指标，与水和抗生素组相似。组织病理学结果显示，g_AMP14、g_AMP33、g_AMP35、g_AMP42、m_AMP46 和m_AMP76的抗炎效果与临床常用抗生素相当，结肠组织切片中未见明显炎性细胞浸润。在AMP处理组和polymyxin B组中，肾组织切片可见少量静脉淤血；但在万古霉素处理组，小鼠肾小管上皮细胞出现胞质稀疏和染色变浅，提示蛋白丢失和细胞功能障碍，并伴有核固缩，显示细胞凋亡或坏死。我们进一步通过连续传代实验评估了可能的耐药性。将CRAB QLH-2022-637和MRSA QLH-2022-718分别在0.5倍MIC的AMPs存在下培养，并以polymyxin B和万古霉素作为对照。结果显示，在AMPs存在下传代20代后，g_AMP33、g_AMP42和m_AMP46对CRAB的MIC始终为8 μg/ml；g_AMP14的MIC从首代的16 μg/ml增至末代的32 μg/ml(2 倍)，m_AMP76则从4 μg/ml增至32 μg/ml(8倍)，而polymyxin B暴露20代后MIC增加32倍(图 5f)。MRSA在亚抑菌浓度AMPs存在下连续传代未出现对g_AMP14(16 μg/ml)、g_AMP35(16→32 μg/ml)和 m_AMP76(32→64 μg/ml)的明显耐药性，而m_AMP46的MIC从 32 μg/ml增至128 μg/ml(4倍)。相比之下，万古霉素暴露14代后MIC迅速升高，并在18代后上升≥128倍(从 0.5 μg/ml 至 ≥64 μg/ml；图 5g)。

图5 体内中性粒细胞缺乏小鼠大腿感染模型的治疗效果评估

a，体内实验模型。
b、c，小鼠大腿组织中 carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii(CRAB 637，b)和 methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA 718，c)感染后的细菌计数结果。

CRAB感染组：无菌水(n=8)、polymyxin B(n=10)、g_AMP14(n=7)、g_AMP33(n=9)、g_AMP41(n=7)、g_AMP42(n=7)、m_AMP46(n=7)、m_AMP76(n=8)。MRSA感染组：无菌水(n=7)、vancomycin(n=8)、g_AMP14(n=7)、g_AMP35(n=7)、g_AMP41(n=7)、g_AMP42(n=7)、m_AMP46(n=7)、m_AMP76(n=6)。每组数据的线条分别表示第1四分位数、中位数和第3四分位数。统计分析采用双侧Wilcoxon秩和检验。

d，抗酶降解实验示意图。
e，将AMPs暴露于含有多种活性蛋白酶的胎牛血清中共4小时，然后通过液相色谱—串联质谱(LC–MS/MS)分析所得溶液中的肽浓度变化。实验重复2次，独立进行。

f、g，CRAB637(f)和MRSA718(g)在0.5倍MIC浓度 AMPs 和抗生素处理下的耐药性获得情况(n=3个生物学独立重复)。

“Water#”表示DNase/RNase无酶、无菌水。a和d中的示意图由BioRender.com绘制。

鉴定的AMPs功能特性表征

我们进一步探究了6种在体内表现出显著治疗效果的最优AMPs的作用机制(MoA)。通过扫描电子显微镜(SEM)监测carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii(CRAB QLH-2022-637)和methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA QLH-2022-718)在AMPs作用下的潜在形态变化，观察到处理后的细菌细胞出现皱缩、变形或穿孔等结构破坏(图 6a 及扩展数据图 5a,b)。接下来，我们利用荧光探针分析AMPs对细菌细胞质膜的影响(图 6b)。将细胞分别用AMPs处理2小时后，与未处理组相比，细胞对膜通透性探针碘化丙啶(PI)的荧光强度在1倍和5倍MIC浓度下显著增强，提示细胞质膜发生破坏(图 6c,d)。随后，使用膜电位敏感探针3,3’-二丙基硫代碳花青碘化物(DiSC3-(5))评估CRAB QLH-2022-637和MRSA QLH-2022-718的细胞膜去极化状态。结果表明，所有AMPs均具有一定的去极化作用，但作用速率有所不同。对于CRAB，采用polymyxin B作为阳性对照(该肽类抗生素已知能诱导膜去极化)；对于MRSA，使用Triton X-100作为阳性对照(其具有非特异性膜破坏能力)。除g_AMP42 外，其余AMPs(g_AMP14、g_AMP33、m_AMP46和m_AMP76)均在作用10分钟后即出现快速去极化反应，其中m_AMP76的去极化效果甚至超过polymyxin B(图 6e)。与CRAB的结果相似，g_AMP14、g_AMP35、m_AMP46和m_AMP76 也在MRSA QLH-2022-718中表现出较快的去极化动力学，其中m_AMP76作用最强(图6f)。这些结果表明，AMPs的作用机制包括破坏细胞质膜结构并导致膜电位去极化。基于SEM观察到的细胞形态损伤，我们进一步开展了转录组分析，发现Escherichia coli ATCC25922在m_AMP76(命名为“Arkwillin”，为从Clavispora lusitaniae 蛋白中挖掘出的加密肽)作用下的基因表达模式与对照组显著不同(P = 0.003)。结果显示，Arkwillin 通过下调 slyB、bamD、bamB和pagP等膜相关蛋白编码基因的表达，破坏了细胞膜的完整性；同时抑制了与脂多糖(LPS)合成与转运、生物膜形成和鞭毛组装相关的基因表达，并上调了与膜通透性相关的膜蛋白编码基因的表达(图6g)。

 

图 6 最优AMPs的作用机制研究

a，CRAB QLH-2022-637与MRSA QLH-2022-718经m_AMP76处理后的扫描电子显微镜(SEM)图像。对照组为未处理的相应菌株。

b，荧光探针PI与DiSC3-(5)的作用示意图，分别用于指示AMPs造成的细胞质膜破坏与膜电位去极化效应。

c，CRAB QLH-2022-637与AMPs共培养(浓度为1倍与5倍 MIC)时的细胞膜通透性变化。
d，MRSA QLH-2022-718与AMPs共培养(浓度为1倍与5倍MIC)时的细胞膜通透性变化。
实验均进行了3次独立重复。PC组为阳性对照(高温处理的细菌+PI)，NC组为阴性对照(未处理细菌+PI)。纵坐标表示PI染色后FSC-A⁻与PI-A⁺的比例。所有AMP处理组及PC组均与NC组进行比较。误差榜表示三次重复实验的标准差。

e，DiSC3-(5)检测结果显示AMPs对CRAB QLH-2022-637细胞膜电位的去极化作用。
f，DiSC3-(5)检测结果显示AMPs对MRSA QLH-2022-718细胞膜电位的去极化作用。相对荧光强度以未处理对照(缓冲液+细菌+荧光染料)为基线计算。数据为3次独立实验的平均值±标准差。

g，与细胞膜或细胞壁合成相关的差异基因表达热图。热图方块的颜色表示基因表达比值的大小：即Arkwillin处理组中该基因的FPKM值与对照组均值的比值。

b中的示意图由BioRender.com绘制。

讨论

我们提出了一种基于生成式人工智能的全新抗菌剂发现方法，使得对抗菌肽空间的高效且广泛的探索成为可能。逻辑上，本研究可分为两个主要部分：第一部分是抗菌肽(AMPs)的数据挖掘与文本生成；第二部分是两种开发策略的比较。

值得注意的是，本研究强调了大语言模型(LLM)在迁移学习领域的关键作用：通过在广泛的文本数据上进行预训练，LLM 展现出能够在不同数据集和任务之间无缝迁移知识的能力。具体而言，ProteoGPT 通过对多种肽类数据集进行精细微调，有效地培育了具有可迁移性的子模型，可用于抗菌肽的生成(AMPGenix)、分类(AMPSorter)以及毒性检测(BioToxiPept)，充分利用了LLM不断演进的能力与领域特定知识的结合优势。

这种“一体多能”的框架不仅适用于AMPs，也适用于其他生物活性物质，充分展示了 LLM 在应对多任务时的适应性与可扩展性，尤其在样本量有限的学习场景中，依然能保持高准确度，这对于数据获取受限或成本较高的领域尤为重要。与依赖多个不同模型叠加的传统方法相比，这种单一模型框架不仅简化了模型管理与维护流程，还提高了整体处理效率与结果一致性。

与以往将抗菌肽(AMP)序列生成和数据挖掘分开进行的研究相比，我们充分利用了大语言模型(LLM)在迁移学习方面的优势，将这两种开发策略整合到同一框架中。此外，通过迁移学习获得的知识，使得AMPs序列的生成效率显著高于传统的数据挖掘方法，这一事实也在实际应用中得到了充分验证。在比较g_AMPs和m_AMPs时，我们观察到一些有趣的趋势：g_AMPs相较于m_AMPs表现出更强和更广谱的抗菌活性，这与AMPSorter和定量构效关系(QSAR)预测的结果一致。g_AMPs是通过迁移模型AMPGenix生成的，该模型利用迁移学习从已有的AMP序列中获得了知识与经验，这意味着模型能够捕捉更广泛的抗菌特性与结构特征，从而更好地生成具有优越抗菌活性的肽分子。相比之下，m_AMPs是直接通过对现有短肽序列进行数据挖掘获得的，其结果可能受限于数据集的质量与覆盖范围，从而导致筛选出的AMPs在抗菌活性和抗菌谱方面存在局限性。值得注意的是，由AMPGenix通过迁移学习模型专门生成的PT系列肽，在抗菌效能方面表现尤为突出，甚至超过了已测试的g_AMPs与m_AMPs。这一结果进一步强调了了生成式语言模型在抗菌肽设计领域的潜力。

本研究中开发的LLM模型(如AMPSorter)主要作为AMPs的定性分类模型，尚无法对抗菌活性进行定量预测。而所采用的QSAR虽为定量算法，但其倾向于偏好具有特定理化性质(如高电荷与高疏水性)的阳离子肽，因此在评估更广谱的AMP类型时存在固有偏差。未来的研究将聚焦于通过基于序列的语言模型，实现对AMP活性更为客观和无偏的定量预测。

方法

数据收集

为了构建模型，本研究共收集了五类数据集：大规模蛋白质组数据集、抗菌肽(AMP)数据集、非抗菌肽(non-AMP)数据集、外部验证数据集，以及毒素与非毒素数据集。

蛋白质组

我们从UniProt(http://www.uniprot.org/)检索了非冗余的典型和异构体蛋白质序列，共计609,216条(下载时间：2022年10月)。这些序列构成的蛋白质库主要有两个用途：(1)用于ProteoGPT模型的预训练；(2)用于构建不同类型的NRSPD(non-redundant short peptide dataset，非冗余短肽数据集)。

ProteoGPT模型预训练

由于计算资源限制及模型训练需求，我们将所有蛋白质序列切分为最大长度为1,000个氨基酸(AAs)的子序列，用作训练语料。

构建不同类型的NRSPD

我们采用滑动窗口法(窗口长度为 L)扫描所有蛋白质序列，以构建多个NRSPD。为避免窗口间序列重叠超过50%，滑动步长设为L/2。在本研究中，L的取值范围为8–30。最终构建了5种 NRSPD，分别对应长度为8–10、11–15、16–20、21–25和26–30个氨基酸的短肽序列，总计410,192,277条非冗余短肽，用于后续AMP数据挖掘。

抗菌肽

AMP 数据主要来源于四个公共数据库：APD3、DBAASP、DRAMP以及CAMP，这些数据库覆盖了来自多种生物来源的大部分已知抗菌肽序列(下载时间：2022年11月)。我们选取了具有抗菌、抗病毒和抗真菌活性且长度小于50个氨基酸(AAs)的AMPs，并对这些序列进行去重与整合，最终获得了16,062条非冗余AMP序列，用于后续分析。

非抗菌肽

Non-AMP 序列来源于UniProt数据库。我们在检索时通过“亚细胞定位(subcellular location)” 筛选“细胞质(cytoplasm)”区域，并排除了功能注释中包含“antimicrobial(抗菌)”、“antibiotic(抗生素)”、“antiviral(抗病毒)”、“antifungal(抗真菌)”、“effector(效应蛋白)”或“excreted(分泌)”等关键词的条目(下载时间：2022年11月)。

数据进一步筛选为长度不超过50 AAs的序列，并去除了重复序列。同时，任何与已知AMP序列完全相同的条目也被剔除。经过整理后，我们获得了16,549条独特的non-AMP序列。

该non-AMP数据集来源广泛包括真核生物(如人类及其他动植物)、原核生物(如Escherichia coli和Salmonella enterica)，以及病毒(如HIV-1和Hepatitis B virus)。

外部验证数据集

外部验证用的AMP序列与用于模型构建的序列完全不同。这些序列来源于APD3、DBAASP、DRAMP、CAMPR4、LAMP2以及BaAMPs数据库。筛选标准包括：序列长度不超过 50 AAs；抗真菌活性强于抗菌活性。此外，我们还从参考文献中提取了370条non-AMP 序列(长度≤ 50 AAs，且不与non-AMP训练集重叠)。为确保外部数据集的独立性，我们排除了任何已在模型训练、验证或测试集中出现过的序列。

毒性与非毒性肽数据集

我们从ToxIBTL(https://server.wei-group.net/ToxIBTL/，下载时间：2023年4月)收集1,932条经实验验证的毒性肽序列，以及1,932条长度为10–50个氨基酸残基的非毒性肽序列。在本研究中，为了与AMPGenix的生成性能进行对比，我们还收集了五种无约束肽生成模型产生的肽序列数据，这五种模型分别为：HydrAMP、Basic、PepCVAE、AMP-GAN、MP-LM。为了保证比较的公平性，我们对上述模型的数据集进行了统一的质量控制与预处理步骤：1.前缀对齐(Prefix alignment)：每条序列的首个氨基酸被限定为以下 10 种残基之一：G、K、F、R、A、L、I、V、S、W。2.数量对齐(Quantity alignment)：每种起始氨基酸残基最多保留 800 条序列，使得每个模型的数据总量控制在 7,000–8,000 条之间。长度对齐(Length alignment)所有序列长度被限定在5–35个氨基酸之间，以与AMPGenix生成序列的长度范围保持一致。经过上述筛选后，各模型的最终有效序列数如下：HydrAMP：8,000条，Basic：7,810条，PepCVAE：7,489条，AMP-GAN：7,906条和AMP-LM：7,405条。

模型构建(Model building)

我们共构建了1个预训练语言模型和3个具备不同功能的迁移学习大语言模型(LLMs)，用于AMP的生成、分类和毒性预测等不同任务。

训练数据集、验证数据集和测试数据集

在AMPSorter和BioToxiPept的模型训练过程中，我们将数据集按照6:2:2的比例随机划分为训练集、验证集和测试集(见图2a)。这些数据集之间相互独立，互不重叠。训练集用于模型的开发与训练，验证集用于超参数调优，测试集用于评估模型的最终性能。为了确保评估的稳健性，我们使用 CD-HIT(v.4.8.1)进行了序列过滤，构建了一个基准测试集。首先，从训练集和验证集中移除相似性大于90%的序列。然后，使用CD-HIT-2D从测试集中排除与前一步中任意序列相似性大于70%的序列。此外，移除了含有非标准氨基酸的序列。经过筛选后，最终得到的基准测试集包含725条AMP序列和1,071条非AMP序列，为与现有AMP分类算法的性能比较提供了可靠基础。这些对比模型包括AMPlify、Macrel、iAMP Pred、AMP Scanner (v.2)、Bert-Protein、AMPir 和 AmPEP。

数据编码与解码

所有序列均使用GPT-2分词器进行编码和解码。分词器将序列编码，转换为模型输入所需的分词格式；同时也将模型输出解码，恢复为氨基酸序列。在序列的起始和结束位置添加了“<|endoftext|>”标记。在模型预训练和微调过程中，为了优化内存使用并平衡训练负载，数据集被划分为多个小片段。这种方法在处理大型数据集时尤为有效，有助于提高训练效率并防止内存溢出。

模型结构

最基础的模型ProteoGPT基于GPT-2架构构建。AMPGenix的模型结构与ProteoGPT完全相同。AMPSorter和BioToxiPept则是在ProteoGPT的末端添加了一个额外的分类模块，将输出维度降至2。关于模型结构的详细信息，可在附录中找到。

模型评价

AMPSorter 和 BioToxiPept 的训练采用了交叉熵损失函数

其中：N是样本数量；yi是样本i的真实标签；p(yi∣x)p(yi|x)p(yi∣x) 是模型在给定输入x的情况下对样本i预测为标签yi的概率。分类模型的评估指标包括准确率(accuracy)、特异性(specificity)、敏感性(sensitivity)、精确度(precision)、F1 分数(F1 score)、Matthews 相关系数(MCC)、受试者工作特征曲线(ROC curve)以及精确率-召回率曲线(PR curve)，定义如下(TP：真阳性；TN：真阴性；FP：假阳性；FN：假阴性；FPR：假阳性率)：

 

使用 scikit-learn(v.1.2.2)中的auc函数计算AUC和AUPRC值。

序列生成模型生成序列的质量和多样性评估指标包括：唯一性(uniqueness，生成序列中独特序列占总序列的比例)、多样性(diversity，生成序列两两之间余弦距离的平均值)、新颖性(novelty，生成序列与已知 AMP 序列之间余弦距离的平均值)以及FCD(Fréchet 距离，用于衡量生成序列与已知 AMP 序列分布的相似性)。

其中N为序列总数，Xi，Xj为序列i和j的特征向量。

式中：N为序列总数，M为已知抗菌肽的个数，Xi，Xj分别为生成和已知抗菌肽的特征向量。

 

其中μ1和Σ1分别是生成序列的均值和协方差，μ2和Σ2分别是已知AMP的均值和协方差。

QSAR分析

QSAR 模型的引入具有特定的背景和目的。为了在相同阈值下比较数据挖掘和文本生成策略，我们引入了QSAR模型，其具有以下几个优势：

(1)明确的阈值设定：QSAR模型可以提供明确的定量阈值，从而选择适量的肽进行进一步验证。

(2)一致的肽类型：通过定量构效关系预测，QSAR模型能够预测阳离子AMP的抗菌活性，并确保所比较的两组肽在类型上保持一致，避免因肽类型不同而产生潜在偏差。

通过将QSAR作为第三方工具引入，我们能够从候选池中选出类型一致的肽，从而提高两种策略在开发效率和抗菌活性方面的可比性。

每条序列均使用文献中描述的方法进行评分，该方法利用肽链中的带电残基和疏水残基来计算相对评分，从而评估肽表现抗菌活性的倾向性：

其中C表示净电荷，H表示总疏水性，MaxScore是在给定系数m = 0.9 和n =1.1(如文献中所述)下，可计算出的Cm Hn的最大值。

基因功能分析

EggNOG mapper(http://eggnog-mapper.embl.de/)在默认参数设置下被用于分析蛋白质编码基因。

肽类和化学物质

纯度大于95%的肽由Synthbio Technology定制合成。每种肽粉末单独分装到多个2 mg的试管中，并在−80°C冰箱中保存。每次实验开始当天将粉末制备成所需浓度使用。二甲基亚砜(DMSO)、环磷酰胺、DiSC3-(5)和万古霉素购自Mcklin。HEPES、多粘菌素B、MTT细胞增殖与细胞毒性检测试剂盒购自Solarbio，丙啶橙(PI)购自源叶。PBS购自Cytiva。Triton X-100购自Sigma-Aldrich。DMEM/高糖培养基和青霉素-链霉素混合溶液(双抗)购自上海中侨新洲生物技术。D-葡萄糖和氯化钾(KCl)购自沪试。除非另有说明，所有化学品均购自Solarbio或中国医药集团。试剂的详细信息见补充表6。

菌株与培养基

大肠埃希菌 ATCC25922、金黄色葡萄球菌 ATCC25923 和白假丝酵母 ATCC10231 购自北京微生物菌种保藏中心(BJMCC)。重症监护室(ICU)分离的耐碳青霉烯不动杆菌(CRAB)QLH-2022-267、CRAB QLH-2022-636、CRAB QLH-2022-637，以及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)QLH-2022-266和MRSA QLH-2022-718 由山东大学齐鲁医院菌株库提供。本研究中，大肠埃希菌 ATCC25922、金黄色葡萄球菌 ATCC25923、CRAB 和 MRSA 菌株在 LB(Luria Bertani)液体/固体培养基中培养。白假丝酵母 ATCC10231 在酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖(YPD)液体/固体培养基中培养。本研究还使用了甘露醇盐琼脂(MSA)、麦康凯琼脂(MCA)、穆勒–辛顿肉汤(MHB)、穆勒–辛顿琼脂(MHA)以及胰蛋白胨大豆肉汤/琼脂(TSB/TSA)培养基，均由 Hopebiol 提供。除非另有说明，所有菌株均在 37°C 下培养。

小鼠

所有动物实验均遵循《实验动物护理原则》(NIH 出版物编号 86–23，1985年修订)进行，并经山东大学动物护理与使用委员会批准(LL20240622)。5 周龄雄性 BALB/c 小鼠购自北京维通利华实验动物公司，饲养在标准特定病原体自由(SPF)单独通风笼中，光照周期为 12 小时光/12 小时暗，湿度 50%，温度 22°C。

抗菌活性测定

为筛选具有更好抗菌活性的抗菌肽(AMPs)，采用改良的Kirby–Bauer纸片扩散法。大肠埃希菌 ATCC25922 和金黄色葡萄球菌 ATCC25923 培养至对数生长期。以MHA平板作为基础培养基。制备 0.75% 琼脂溶液，灭菌后冷却至约 55°C。将 100 μl 菌悬液加入 7 ml 熔融琼脂中，充分混匀后倒在预先凝固的MHA基底平板表面，形成双层琼脂平板，并在室温下固化。将直径7 mm的无菌滤纸圆片放置在双层平板表面，每个圆片中心加入测试化合物。所有平板在 37°C 下孵育 16 小时。孵育结束后，用毫米记录抑菌圈直径以评估化合物的抗菌活性。所有 196 条肽首先以 128 μg 浓度进行初步筛选，然后以 64 μg 浓度进一步筛选
。为测定最小抑菌浓度(MIC)，将 58 条筛选出的肽溶解于 MHB 中，初始浓度为 2,560 μg ml−1，随后进行两倍梯度稀释。大肠埃希菌 ATCC25922 和金黄色葡萄球菌 ATCC25923 分别以1 × 10^8 c.f.u.s ml−1 的浓度悬浮于测定培养基中。然后，在 96 孔板中，将每孔100 μl AMP 溶液加入100 μl菌悬液中，平板在 37°C 下孵育 16 小时。最终，使用肉汤微量稀释法从中筛选出20条候选AMP。随后，将这些AMP溶解于MHB中，初始浓度为1,024 μg ml−1，进行两倍梯度稀释。大肠埃希菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌 ATCC25923、CRAB QLH-2022-267、CRAB QLH-2022-636、CRAB QLH-2022-637、MRSA QLH-2022-266 和 MRSA QLH-2022-718 在 LB 培养基中以 37°C、120 r.p.m. 培养至对数生长期。白假丝酵母 ATCC10231在YPD培养基中以 30°C、120 r.p.m. 培养至对数生长期。各菌株分别以 105 c.f.u.s ml−1 的浓度悬浮于测定培养基中，然后在 96 孔板中将每孔 100 μl AMP 溶液加入 100 μl 菌悬液中，平板在 37°C 下孵育 16 小时。按照既往报道，用 TECAN Spark 微孔板读数仪测量 625 nm 光密度(OD)值。

候选 AMP 的溶血作用

新鲜收集的绵羊红细胞购自Solarbio，首先用 PBS 洗涤至离心(491 × g)后上清清澈，然后分配到 96 孔平底板中。将各 AMP 稀释后加入孔中，最终浓度对应其在高接种量(10^8 c.f.u.s ml−1)条件下对大肠埃希菌 ATCC25922 和金黄色葡萄球菌 ATCC25923 的最大 MIC 值。在 37°C 下孵育 1 小时后，将细胞以2,996 × g离心10 分钟。PBS和Triton X-100分别作为阴性对照和阳性对照。去除上清液后测定OD450。所有实验均进行了三次独立重复。溶血率按以下公式计算：

哺乳动物细胞细胞毒性

候选AMP的细胞毒性通过MT 细胞增殖与细胞毒性检测试剂盒测定。HEK293 细胞(FUNHENG BIOLOGY)接种于 96 孔平底板，每孔 5,000 个细胞，培养于细胞培养基中。在 37°C、5% CO₂ 条件下孵育 24 小时后，更换新鲜培养基，并加入 AMP(终浓度：100 μg ml⁻¹)，继续孵育 48 小时。通过加入 MTT 溶液并在 4 小时后测定 OD490 来监测细胞活力。实验过程中设置零孔和对照孔。所有实验均进行了三次独立重复。细胞存活率按以下公式计算：

小鼠中性粒细胞缺乏性大腿感染的建模与治疗

小鼠在细菌接种前4天和1天腹腔注射环磷酰胺，剂量分别为150 mg/kg和100 mg/kg，以诱导中性粒细胞减少。MRSA QLH-2022-718 和 CRAB QLH-2022-637分别悬浮于无菌PBS中，调整浓度至每个感染部位约106c.f.u.s，并注射到相应实验组小鼠的右大腿。随后，在感染后 1、3、5 和 7 小时腹腔给予AMP(10倍MIC，100 μl；大多数AMP组小鼠数量 Nmice = 7；MRSA 感染的 m_AMP76 组 Nmice = 6；CRAB 感染的 g_AMP33 组 Nmice = 9；CRAB 感染的 m_AMP76 组 Nmice = 8)、无菌水(CRAB 感染 Nmice = 8，MRSA 感染 Nmice = 7)、多粘菌素 B(20,000–25,000 U/kg/天，Nmice =10)或万古霉素(40 mg/kg，Nmice = 8)。感染24小时后，处死小鼠，收集大腿创伤组织，称重、匀浆，并在无菌PBS中进行连续稀释。通过将大腿组织匀浆(0.25 g大腿组织加入10 ml无菌 PBS)接种在MSA平板和MCA平板上，分别计算每个大腿创伤组织中 MRSA QLH-2022-718 和 CRAB QLH-2022-637 的菌落形成单位(c.f.u.)。

小鼠肾脏和结肠的组织学变化

组织样本固定于4%多聚甲醛中至少24小时，经过梯度乙醇脱水、二甲苯透明化后嵌入石蜡。切片厚度为4 μm，置于载玻片上并在60 °C下干燥。切片脱蜡、复水后用苏木素染色3–5分钟，分化、蓝化，再用伊红复染15秒，随后脱水、透明化并用中性树胶封片。图像使用光学显微镜获取。

16S rRNA 测序与分析

采用EasyPure粪便基因组DNA试剂盒(EE301-01, TransGene)提取小鼠盲肠和结肠内容物的DNA，并在Illumina Nova 6000平台上进行测序。Shannon 指数使用 QIIME2 计算。欧氏距离矩阵使用 ‘dist’ 函数计算，并用 ‘hclust’ 函数绘图(base R 包)。主坐标分析(PCoA)及置换多变量方差分析(PERMANOVA)使用 vegan R 包中的 adonis2 进行。

蛋白酶降解抗性实验

将 AMPs 在胎牛血清(FBS)中孵育以评估其酶降解抗性。肽暴露于25% FBS 水溶液中，浓度为2 mg/ml，在37 °C下孵育4 小时。分别在0、0.5、1、2 和4小时时取样，加入200 μl乙腈至每个样品(100 μl)，在4 °C下孵育 10 分钟。随后样品在 AB SCIEX QTRAP 5500系统中处理。使用的色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(3.5 μm, 2.1 mm × 150 mm)，流动相为 A(100% 水含 0.1% 甲酸)和 B(100% 乙腈含 0.1% 甲酸)。通过多反应监测(MRM)进行检测。未降解肽的百分比通过积分零时刻的肽相关 AUC 计算。流动相组成的时间梯度列于补充表 7。

细菌耐药性发展实验

在96孔聚丙烯平底板中，将5 μl过夜细菌培养液加入含有AMP/抗生素的MHB溶液中，每孔细胞密度为105 c.f.u.s。板在 37 °C 下孵育 20–24 小时。测定每种细菌的 MIC，即使无明显细菌生长的最低肽/抗生素浓度。随后，将 0.5 倍 MIC 的生长悬液 5 μl 转接至新培养基中，含相同浓度的 AMP/抗生素，每孔 10⁵ c.f.u.s，重复上述孵育，连续传代 20 次。

扫描电子显微镜(SEM)测量

菌株培养至指数生长期。将细菌悬液(108c.f.u.s/ml)与 AMP(终浓度100 μg/ml)在37 °C共培养24小时，未处理细胞作为对照。样品使用Hitachi FE-SEM Regulus8100扫描电子显微镜观察。

肽诱导的细胞膜通透性检测

单菌落接种培养至指数生长期，随后用 10 mM PBS(pH 7.0)洗涤三次，并用PBS调整OD625至0.08~0.13。取150 μl细菌悬液与50 μl AMP(溶于PBS)在37°C 孵育 2 小时。加入PI至最终浓度50 μg/ml，在暗处37 °C孵育 30 分钟。随后细菌悬液离心(4 °C, 1,825 × g, 10 分钟)并用PBS洗涤两次。所有实验均进行了三次独立重复。处理后的细胞通过流式细胞仪(ThermoFisher Attune NxT)检测，数据使用 FlowJo(v.10.8.1)分析。

DiSC3-(5) 实验

CRAB QLH-2022-637和MRSA QLH-2022-718在37 °C下振荡培养至对数中期。随后，将细胞离心并用洗涤缓冲液(20 mmol/l葡萄糖，5 mmol/l HEPES，pH 7.2)洗涤两次，再重悬于含 0.1 mol/l KCl 的相同缓冲液中，使OD600调整为 0.05。取100 μl细胞悬液，与20 nmol/l DiSC3-(5)孵育15分钟，直至荧光减弱稳定，表明染料已嵌入细胞膜中。随后，通过观察膜电位敏感染料DiSC3-(5)的荧光发射强度变化(激发波长lex = 622 nm，发射波长lem = 670 nm)来监测细胞膜去极化情况。加入肽溶液(100 μl，按 MIC 值浓度)后，计算相对荧光强度：

 

RNA 测序与分析

对E. coli ATCC25922用AMP(1倍MIC)处理2 小时，共六个重复组，对照组使用 PBS。RNA测序通过 Illumina NovaSeq 平台进行。使用HTSeq v.0.6.1统计映射到每个基因的读取数，然后计算每个基因的每千碱基转录片段数每百万映射片段数(FPKM)。差异表达分析使用 DESeq R 包进行。主坐标分析(PCoA)和置换多元方差分析(PERMANOVA)通过 adonis2(vegan R 包)完成。

研究报告摘要

研究设计的更多信息可参见本文链接的 Nature Portfolio Reporting Summary。

数据可得性

本研究包含公开可获得的蛋白质组、AMP、非 AMP、毒性与非毒性肽、生成的序列、16S rRNA基因测序和RNA-seq数据。蛋白质序列来源于UniProt(http://www.uniprot.org/，下载时间为 2022 年 10 月)。AMP 数据主要收集自六个公共 AMP 数据集：APD3 (https://aps.unmc.edu/AP/)、DBAASP (https://www.dbaasp.org/home)、DRAMP (http://dramp.cpu-bioinfor.org/)、CAMP (http://www.camp3.bicnirrh.res.in/)、LAMP (http://biotechlab.fudan.edu.cn/database/lamp)和 BaAMPs (http://www.baamps.it)，覆盖了大部分来源的 AMP 序列(下载时间为2022年11月)。非AMP数据集从UniProt下载(https://www.uniprot.org)，通过设置“subcellular location”为胞质，并移除在功能注释中包含关键词 antimicrobial、antibiotic、antiviral、antifungal、effector 或 excreted 的条目(下载时间为 2022 年 11 月)。毒性与非毒性数据收集自 https://server.wei-group.net/ToxIBTL/(下载时间为 2023 年 4 月)。用于模型构建的相关数据、构建与生成的短肽数据集，以及预测结果已上传至 Zenodo(https://doi.org/10.5281/zenodo.16633186)。五个非受约束生成模型产生的序列数据收集自https://zenodo.org/records/7420189#.ZBCo4JHMKUk(下载时间为 2024 年 10 月)。16S rRNA 基因测序和 RNA-seq 数据可通过国家组学数据百科全书(NODE)获取，登录号为 OEP00006445 和 OEP00005095。本文提供了原始数据。

代码可用性

AMP生成和预测代码可以在GitHub上的https://github.com/W1V1995/AMP_ Project中找到。