Cell Host & Microbe|抗生素耐药性：威胁公共卫生的核心微生物生存机制

【文献分享】抗生素耐药性：威胁公共卫生的核心微生物生存机制

原名：Antibiotic resistance: A key microbial survival mechanism that threatens public health

IF:18.7发表时间：2024.6.12通讯作者：Gerard D. Wright摘要

抗生素耐药性（AMR）已成为全球公共卫生重大威胁，它显著削弱了抗生素治疗细菌感染的有效性。这一现象本质上也是细菌进化出的关键生存策略。数亿年前，抗生素作为微生物产生的有益次级代谢产物自然出现，因此AMR同样源远流长，并深植于细菌的遗传基础之中。人类将抗生素用于疾病治疗这一行为形成了选择压力，不仅催生了新型耐药机制的产生，更促使现有耐药基因在环境、动物和人类体内的细菌群体间传播扩散。这种由遗传元件构成的耐药网络兼具基因复杂性与机制多样性。要应对这种细菌生存策略，需要持续推动科技创新并加大资源投入，以保障未来抗生素的可持续应用。当前应对日益严峻的AMR危机的策略包括：研发新型疗法、应用人工智能技术监测耐药性趋势以及加速新药研发等关键路径。

引言

抗生素耐药性（AMR）已成为21世纪医学与公共卫生领域面临的生存性威胁。自百年前被发现以来，抗生素已成为现代医学的基石，为细菌性感染疾病的治疗与预防提供了关键手段。难以想象若失去安全有效的抗生素，医疗体系将面临何等挑战。然而，随着AMR在全球范围内持续加剧，波及所有国家与医疗部门，人类治疗感染的能力正面临倒退的风险。COVID-19大流行进一步恶化了这一问题，并加速了AMR的传播与新型耐药机制的出现。例如，美国疾控中心报告显示，疫情期间该国医院内耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌和肠杆菌目的检出率显著上升。尽管其根本原因尚未完全明确，但疫情初期不当的抗生素处方，以及重症COVID-19患者需长期使用呼吸机与导管（此类治疗常伴随抗生素用量增加）可能是重要诱因。

抗生素的另一重要作用在于其对食品、畜牧业及农业领域中感染控制的贡献。随着全球人口从抗生素时代初期的约20亿增至当前的约80亿（增长达4倍），人类对稳定食物供给以保障营养的需求也日益迫切。抗菌药物在食品工业中对于防控畜禽感染、保障水果蔬菜及其他主食生产具有不可替代的作用。目前多数司法管辖区已规范食品与畜牧业中抗生素的使用，以避免人畜共用同类药物。然而部分地区对此类规定的执行仍显松懈。更值得注意的是，即使非人用抗生素亦可能通过交叉选择作用引发同类化学结构抗生素的耐药性，或通过共选择作用促使可移动多重耐药元件上的相邻耐药基因传播。因此，抗生素耐药性不仅冲击医疗卫生体系，更将对未来人类的粮食安全产生深远影响。

随着对抗生素耐药性（AMR）挑战认识的不断深入，国家及国际机构多年来持续强调这一威胁的重要性。世界卫生组织、美国疾控中心、欧洲卫生机构以及包括G7和G20在内的全球网络均已呼吁采取行动应对AMR威胁。然而，具有显著成效的国际协同倡议至今仍付诸阙如。

当前AMR危机在警示抗生素重要性及其易产生耐药性特征的同时，更促使我们认识到：AMR实质是细菌通过自然选择在数百万年进化过程中锤炼而成的生存策略。化石证据表明细菌早在34亿年前就已出现。基因组学研究显示，微生物体内抗生素生物合成及与之相伴的（防止细胞自毁所必需的）耐药机制的出现可追溯至深远过去——β-内酰胺类约20亿年前，糖肽类约5亿年前。在人类开始使用抗生素之前，耐药元件早已存在于细菌群体中，其作用范围并非全球尺度的大规模制造与使用，而是局限于微生物相互作用的、以微米计量的微环境。鉴于漫长的地质时间尺度、地球上庞大的微生物数量，以及"适者生存"这一强大的自然选择法则，细菌已演化出诸多规避抗生素的分子策略（图1）。这种强大的生存特性使微生物能有效抵御周边微生物产生的毒性物质，从而获得显著生存优势。耐药元件的表达进而推动了新型抗菌化学实体生物合成的"报复性"进化——这些新机制不受现有耐药途径影响，使微生物在数百万年间重获竞争优势。环境微生物普遍呈现高度多重耐药性的现象，正是这场持续数百万年进化角逐的实证。

过去数十年来，人类以前所未有的规模使用抗生素，加之农业活动与水处理等过程导致环境细菌与人类、动植物微生物组相互交融，这为AMR在原本罕有接触的生物体间的加速传播创造了条件。其直接后果是，古老的生存基因向致病菌转移并被筛选固定，最终导致我们有效运用抗生素的能力持续受损。本文旨在将当前AMR危机置于细菌生存策略可预测性表达的框架中进行解读，并通过案例探讨可能的缓解途径。

图1 抗生素耐药性作用机制

（A）渗透性降低：由外膜和代谢物门控孔蛋白构成的物理化学屏障可调控分子进入细胞，阻止抗生素渗透。

（B）外排系统：外排泵蛋白能在抗生素抵达靶点前将其排出胞外。

（C）靶标规避与抗生素代谢（绿色阴影表示抗生素作用于靶点，红色阴影表示抗生素失效）：

（i）抗生素失活：通过修饰或降解使抗生素失活的酶类；

（ii）靶标保护：保护蛋白通过空间位阻效应遮蔽抗生素作用靶点；

（iii）靶标修饰：靶标修饰酶通过改变抗生素作用靶点的结构，阻止抗生素结合；

（iv）靶标突变：抗生素作用靶点通过基因突变引发构象改变，导致抗生素无法识别/结合。

抗生素与耐药性

尽管已有诸多专著与综述详述抗生素及其作用靶点，本节仍将采用宏观视角简要概述，略去细节以保持行文简洁。抗生素可根据分子靶点、功能作用及化学结构进行分类。相较于其他治疗领域，抗生素的作用靶点较为有限，主要集中于细胞膜、蛋白质与核酸合成，以及细胞壁肽聚糖组分的生物合成过程。细胞壁作为细菌特有结构，是极具价值的药物靶点；而蛋白质与核酸合成分子机器虽在基础机制上与动物细胞相似，但其精细结构和功能差异足以成为理想的药物靶点。另一方面，细菌细胞膜与人类细胞膜具有相似的物理化学特性，使其通常不作为优选靶点，但膜靶向抗生素在局部用药中仍具重要价值。

最成功的细胞壁靶向抗生素当属β-内酰胺类（青霉素、头孢菌素、碳青霉烯类和单环β-内酰胺类）；其他细胞壁生物合成抑制剂如糖肽类和磷霉素亦具临床价值。干扰蛋白质合成的抗生素主要作用于50S或30S核糖体亚基——这些亚基比人类核糖体亚基（60S与40S）更小且结构更简单。靶向30S亚基的抗生素包括四环素类与氨基糖苷类，而大环内酯类、林可酰胺类及氯霉素则作用于50S亚基。磺胺类药物作为首个广泛应用的抗细菌感染化合物，通过抑制胸苷合成所必需的叶酸合成，间接干扰DNA合成。喹诺酮类通过阻断DNA复制必需的解旋酶发挥作用，利福霉素类则抑制RNA合成。值得注意的是，在其他治疗领域成效显著的现代靶向药物研发策略，在拓展抗生素靶点范围方面至今未获突破。

自砷凡纳明（1910年代）与磺胺类（1930年代）相继问世，青霉素于1940年代初被发现以来，科学家与临床医师已意识到：在临床相关浓度下，细菌群体接触这些药物会筛选出耐受其毒性效应的耐药菌株。首例青霉素酶介导的失活现象报道甚至早于该药物的广泛使用。青霉素发现者之一亚历山大·弗莱明在1945年诺贝尔获奖演说中即敲响AMR警钟，明确指出耐药性将危及这类救命药物的持续有效性。此后我们逐步认识到，AMR是细菌通过获得遗传变异、捕获新基因乃至基因盒来抵御抗生素毒性的自然古老现象。该表型可通过染色体突变（基因组复制中的随机错误）或获得耐药元件（如质粒、转座子通过群体水平转移，以及整合子捕获外源DNA）而产生。庞大细菌群体、细胞分裂中DNA复制固有的不精确性、水平基因转移，加之自然选择的力量，共同导致AMR成为可预测且持续进化的过程。因此，AMR已成为细菌在自然环境与临床环境中的核心生存策略。

多数抗生素通过结合细胞内蛋白质或核酸分子靶点发挥毒性作用，故细胞渗透屏障可能是最古老的耐药机制之一（图1）。这类机制包括：革兰氏阴性菌外膜与代谢物门控孔蛋白构成的物理屏障，可精确调控分子由胞外至胞内的渗透；革兰氏阳性菌的壁磷壁酸等胞外阴离子聚合物。对于革兰氏阴性菌，内膜与外膜各自形成独特的物理化学屏障，药物必须穿透这两层结构才能进入细胞。作用于细胞表面靶点的抗生素（如β-内酰胺类）较不易受此类耐药机制影响。与抗生素渗透屏障相对的是细菌固有或获得的外排系统。目前已知细菌代谢物外排蛋白可分为五大分子类别，均与AMR相关（表1）。此外，单个微生物可编码多类别、多等位基因的外排系统及具有高度差异化底物识别能力的基因，从而对试图渗透并在胞质内积累以结合靶点的化合物提供全面防护。例如，大肠杆菌预测拥有36种外排泵，敲除这些基因可显著增强其抗生素敏感性。

 

表1 抗生素外排泵的五大类别

Class	General structure	Function
ATP结合盒式蛋白(ATP-binding cassette transporter，ABC)	二聚体结构，包含12个结合抗生素底物的跨膜结构域，以及两个位于细胞膜胞质侧的核苷酸结合结构域。	通过ATP水解驱动的交替轴向构象变化，实现抗生素及其他代谢物的跨膜转运（兼具输入与输出功能）。常见于抗生素生物合成基因簇，如粪肠球菌EfrAB。
主要协同转运蛋白超家族 (Major facilitator superfamily,MFS)	单体结构，由12或14个跨膜螺旋组成两个功能结构域。	通常通过"摇杆式"机制，将抗生素外排与质子内流相耦合（反向转运机制），如金黄色葡萄球菌NorA。
多药与有毒化合物外排蛋白家族（Multidrug and toxic compound extrusion   family ，MATE)	包含12个跨膜螺旋，其N叶与C叶呈现伪二次对称结构，具有独立的抗生素和离子结合位点。	利用钠离子或质子的跨膜电化学梯度驱动构象变化，实现药物外排，如淋病奈瑟菌NorM。
小多重耐药家族（Small multidrug resistance family ，SMR)	二聚体结构，每个单体含4个跨膜螺旋。	利用质子动力势，对多种季铵盐化合物及部分抗生素产生耐药性，如鲍曼不动杆菌AbeS。
耐药-结瘤-分裂家族（Resistance nodulation division family   ，RND)	三联体复合结构，由外膜蛋白、周质适配蛋白和内膜RND转运蛋白组成。	以强大的抗生素化合物外排能力著称，是革兰氏阴性菌抗生素耐药性的关键机制，如大肠杆菌AcrAB-TolC系统。

在另一种耐药机制中，蛋白质及RNA分子靶点可通过积累对抗生素-靶点结合至关重要的突变，从而对抗生素变得不敏感。在抗生素存在的压力环境下，这些可能伴随代谢负担的突变能够通过代偿性突变的筛选，在基因组中被永久固定。与之并行的是，耐药酶通过对分子靶点进行修饰以阻断抗生素的对接（图1C）——例如，化学修饰rRNA中核糖核苷酸碱基的甲基转移酶，可使细胞对多种类别抗生素产生抗性。另一种使靶点对抗生素不敏感的策略是通过保护蛋白（图1C），这类特异性元件通过与分子靶点结合，干扰抗生素-靶点的有效结合。在针对糖肽类抗生素万古霉素的耐药性中，可见到靶点改变机制的一个显著变体：万古霉素通过五个氢键与肽聚糖中的D-丙氨酰-D-丙氨酸二肽结合（图2A）。耐药菌株通过简单的单原子替换（用氧原子取代氮原子），将D-丙氨酰-D-丙氨酸替换为D-丙氨酰-D-乳酸，使酰胺键转变为酯键，从而将抗生素亲和力降低千倍（图2B）。

图2 通过改变靶点中的单个原子实现对糖肽类抗生素的耐药性

(A) 糖肽类抗生素（如万古霉素）通过与其肽聚糖前体中的D-丙氨酰-D-丙氨酸末端形成五个氢键，从而阻断细胞壁合成。
(B) 细菌通过合成D-丙氨酰-D-乳酸酯键替代原有的酰胺键，该单原子取代（氧原子取代氮原子）破坏了氢键结合所需的分子结构，导致抗生素无法有效结合靶点。

耐药机制的终极形式，当属那些堪称精英攻击小队的抗生素灭活酶——它们构成了对抗多种抗生素类别的强大防线（图3）。这类酶包括能够直接破坏抗生素结构的蛋白质，例如可水解青霉素、头孢菌素、单环β-内酰胺及碳青霉烯类抗生素中β-内酰胺环的β-内酰胺酶。此外，细菌还可调动多种通过转移亲电修饰基团（如酰基、磷酸基、糖基）对抗生素进行化学修饰的修饰酶。氧化还原反应同样可被用于耐药机制，例如通过抗生素单加氧反应实现耐药。

 

图3 抗生素的酶促灭活机制

酶类物质可通过水解、羟基化、酰基化、磷酸化及糖基化等方式对抗生素分子进行结构修饰，从而使其生物活性丧失。

耐药元件在漫长地质年代中演化出的惊人机制与遗传多样性，构成了几乎必然产生耐药性的基因组背景。抗生素耐药性机制的广泛性、经实验验证的数千种耐药相关基因（在精心编纂的全面抗生素耐药性数据库https://card.mcmaster.ca/中收录逾5000个基因），以及这些元件在全球和环境中的广泛分布，使AMR堪称微生物在种间竞争与化学逆境中生存策略的成功典范。因此，深刻理解耐药性的分子机制、进化规律、分布特征及其可移动性，对于应对AMR危机至关重要。

细菌抗生素防御机制研究新进展

多数细菌在遗传层面具备演化或获得耐药性的倾向。已有诸多综述总结了细菌在抗生素压力下的生存机制，但关于耐药性进化与机制仍存在大量未知领域。近年来在体外进化研究、抗生素外排及靶点保护机制等方面取得的进展，为理解细菌自我防御的分子机制多样性提供了新见解。

通过体外培养细菌并施加抗生素压力来探索耐药性进化的体外进化研究，可揭示耐药性的遗传演化路径。这类分析能解析细菌耐药性的进化潜力，有助于探索新机制、预测耐药性出现并制定应对策略。在利用大肠杆菌长期进化实验的里程碑研究中，Lenski团队揭示了初始遗传背景和进化路径随机性对耐药性演化的关键影响。该研究还表明耐药突变大多具有抗生素特异性，但转运相关基因常参与其中。这些发现与早期研究一致：对于氯霉素等抗生素，耐药性可能由多个看似无关基因的复杂突变共同导致；而对于甲氧苄啶等药物，耐药谱系则多集中于靶点二氢叶酸还原酶的突变。

内在外排系统是体现进化潜能的典型范例。近期研究强调，内在外排蛋白的过表达是抗生素耐药性的重要模式。在头孢他啶压力下培养的机会性革兰阴性菌嗜麦芽窄食单胞菌，其编码SmeGH RND外排泵的smeH基因发生突变，该突变同时导致对其他β-内酰胺类抗生素的交叉耐药，展示了耐药性对同类药物的潜在连锁效应。类似地，金黄色葡萄球菌norA外排泵的扩增增强了对环丙沙星的耐药性。两项研究均显示，在无抗生素环境下，外排泵基因过表达未引起细菌显著的适应性代价。这些案例说明，抗生素暴露后内在外排泵系统的上调如何促进耐药性增强和细菌存活。

针对耐药性进化的逻辑性对策是开发多靶点抗生素。例如高效β-内酰胺类抗生素能同时阻断同一细胞内的多种肽聚糖转肽酶。理论上，多靶点同时发生耐药突变的概率降低，应有利于延长抗生素有效期。然而菌株仍进化出针对此类药物的耐药性。如德拉沙星等氟喹诺酮类药物同时靶向DNA旋转酶和拓扑异构酶IV以降低耐药风险，但在耐甲氧葡萄球菌中，新发现的外排泵编码基因sdrM的过表达可增强对德拉沙星的耐药性，规避了对两个靶酶同时突变的需求。这些研究揭示了外排系统给抗生素研发带来的严峻挑战，以及其为细菌应对毒性分子提供的强大防御能力。

另一类耐药策略是通过物理保护抗生素靶点，从而阻断有效靶点结合与抗生素作用。不断增多的ABC-F蛋白家族便是典型代表，它们介导对多种靶向核糖体抗生素的耐药。这类蛋白广泛分布于革兰阳性菌和部分革兰阴性菌中，其特点是通过α螺旋连接子串联ATP结合 cassette结构域，但缺乏常见ABC外排系统的跨膜结构域（表1）。因此，ABC-F蛋白是通过外排还是其他核糖体相关机制介导耐药曾存争议。最新研究证实，ABC-F蛋白能保护核糖体免受酮内酯、林可酰胺、大环内酯、噁唑烷酮、苯醇、截短侧耳素和链阳霉素等众多抗生素的影响，这些药物均靶向50S亚基的肽基转移中心。O'Neil团队首次发现金黄色葡萄球菌ABC-F蛋白Vga(A)通过核糖体保护机制介导耐药。近期多项针对不同细菌ABC-F蛋白的冷冻电镜研究验证了这一假说，显示这些蛋白与核糖体形成紧密复合体，结合于核糖体E位点。共识性分子机制逐渐明晰：球状ATP结合结构域结合E位点，α螺旋结构域间连接子延伸至50S亚基内指向抗生素停滞核糖体的PTC区域。连接两个α螺旋结构域的肽环在PTC处与23S rRNA相互作用，破坏抗生素结合并导致药物解离；ATP水解将ABC-F蛋白从核糖体释放，使翻译过程得以重启。

在利福霉素抗生素研究中近期报道了新型靶点保护策略的发现。如利福平和利福布汀等利福霉素是治疗结核病和非结核分枝杆菌的WHO基本药物。靶点突变导致的利福霉素耐药在单药治疗中快速出现，故常需联合用药。在脓肿分枝杆菌和委内瑞拉链霉菌中同时报道了由HelR解旋酶样蛋白提供的靶点保护机制。HelR的产生由利福霉素暴露诱导，并能结合RNA聚合酶。在其分子机制中，HelR与利福霉素停滞的RNA聚合酶结合，引发构象变化进而驱动其蛋白环状结构介入RNA聚合酶上邻近利福霉素结合位点的区域，从而置换抗生素。此过程无需ATP水解，但解离蛋白复合体可能需ATP参与。

近年来，新型抗生素灭活酶不断被发现和表征。β-内酰胺类作为医学领域最成功的抗生素类别，其耐药性主要通过产生β-内酰胺酶来实现。这类水解酶通过两种主要机制发挥作用：通过活性位点亲核丝氨酸残基攻击β-内酰胺环形成共价酶中间体，或依赖Zn²⁺的金属酶激活水分子进行开环亲核攻击。自20世纪中期以来，Ser β-内酰胺酶在临床耐药中占主导地位，而金属β-内酰胺酶关注较少。2009年新德里金属β-内酰胺酶NDM-1的首次报道改变了这一局面。这种锚定于外膜的脂蛋白酶能高效介导对青霉素、头孢菌素以及碳青霉烯类美罗培南的耐药——碳青霉烯类本是治疗革兰阴性菌感染的"最后防线"药物。此后多种NDM变体通过可移动遗传元件在微生物属种间传播，现已遍布全球。随着碳青霉烯因AMR导致治疗失败而使用增加，新型金属β-内酰胺酶如源自机会病原体吲哚金黄杆菌的CIM-1仍在不断涌现。

多粘菌素是另一"最后防线"抗生素，这种阳离子肽类抗生素虽因肾毒性曾仅零星使用，但随着对更安全抗生素耐药性加剧而重返临床。2016年首次报道质粒介导的多粘菌素耐药。该质粒编码磷酸乙醇胺转移酶Mcr-1，可修饰多粘菌素的靶点脂质A。携带mcr-1及其多种变体的可移动遗传元件因多年在食品生产中的使用，现已分布于食品动物、环境及人类群体中。mcr-1案例凸显了从One Health视角审视AMR的重要性。One Health指人类健康与动物及环境健康相互关联，某一领域的耐药性选择压力可迅速波及其他领域。

抗生素耐药性与One Health交汇的另一案例是氨基糖苷类抗生素安普霉素的乙酰转移酶ApmA。该抗生素长期作为饲料添加剂用于食品动物而非人类疾病治疗。随着AMR对临床抗生素的威胁加剧，重新评估安普霉素用于人类的努力正在推进。鉴于其在食品动物生产中的长期应用，首次在牛猪源MRSA质粒上发现耐药酶ApmA编码基因不足为奇。ApmA是左手β螺旋蛋白超家族中罕见的N-乙酰转移酶，与其他氨基糖苷类灭活酶相比具有独特作用模式。

这些最新发现彰显了细菌在抗生素挑战下为维持生存所部署耐药机制的惊人多样性。

抗生素耐药性的起源与多样性

抗生素的现代发展史遵循着一个众所周知的模式：抗生素被引入临床使用，随着时间的推移，耐药性的出现几乎不可避免。所有类别的抗生素均未能逃脱这一规律。对于新型药物，其未知之处在于耐药性产生所需的时间跨度、影响的细菌谱系以及相关的分子机制。尽管临床分离株中AMR出现的时间点存在不确定性，但大量证据表明这些抗菌药耐药基因的存在独立于人类活动。如前所述，AMR是一种古老的生存特性，比人类使用抗生素早数千年，并已深深融入细菌基因组的自然演化史中。

当代环境细菌中可找到耐药性普遍存在的证据。近期一项研究通过鸟枪法宏基因组学检测了来自南极的原始表层土壤样本，调查了自然存在的耐药元件。共鉴定出177个耐药基因，其中大部分为外排泵；此外还检测到其他机制，包括新型β-内酰胺酶以及对氨基糖苷类和氯霉素具有修饰作用的乙酰转移酶。一项针对2012至2019年间采集的全球土壤样本调查显示，在1,012个土壤点位中，主要耐药元件与外排机制及Fox5 β-内酰胺酶相关。

河流、湖泊和海洋系统是独特微生物和耐药基因的另一来源。无人区水域已被证实携带不受人类活动影响的耐药基因。例如，对中亚未受干扰的冰川环境调查发现，存在针对22类抗生素的耐药基因，包括β-内酰胺类、糖肽类等。深海环境同样存在耐药元件。一项研究探索了从马里亚纳海沟超深渊带（海面下6-11公里）采集的沉积物中的AMR基因。虽然较浅层样本的耐药基因丰度更高，但深海沉积物中仍存在20种已知耐药基因亚型以及与肉毒杆菌、破伤风及艰难梭菌毒素相关的毒力基因。环境细菌耐药性的遗传与机制多样性现已得到充分证实。

环境中耐药基因的积累不仅与内在机制相关，更因人类医疗和动物生产中抗生素的过度使用而加剧。水系统污染会恶化环境耐药性的选择压力。位于法国和瑞士边境的日内瓦湖因污水处理厂造成严重污染，该区域持续进行AMR监测。湖体中此前已检测到针对磺胺类、四环素类和喹诺酮类的耐药基因，其持续存在归因于湖底沉积物中的污染物。针对污水处理厂污染对河流及海洋系统影响的研究也显示类似结果，磺胺类、β-内酰胺类和氨基糖苷类耐药基因普遍存在。

环境耐药基因库与临床之间的联系日益明晰。一项通过富集耐药土壤蛋白菌的研究发现，许多耐药元件与临床分离株的序列高度保守甚至完全相同。检测到包括β-内酰胺类、四环素类、氨基糖苷类和磺胺类在内的多种耐药编码基因，且其基因邻接性与临床重要病原体中的常见相邻元件保守一致。该研究证实了环境中的AMR与临床耐药性之间存在直接关联。环境耐药基因与临床分离株基因存在完全或近乎完全的核苷酸相似性，暗示这些基因通过水平基因转移进行传播。

AMR通过三种主要HGT机制在细菌群体中传播：转导、转化和接合（图4）。在转导过程中，噬菌体作为染色体或胞外供体DNA载体，可诱导受体细胞获得新性状（包括抗生素耐药性）。转化是细菌直接摄取常来源于裂解细胞的胞外DNA。细菌接合则通过菌毛或孔道等特殊结构，通过物理接触交换遗传信息。所有HGT机制均允许不同菌种间耐药基因的转移，从而在细菌群落中传播耐药性。虽然耐药基因交换可通过任一机制实现，但接合是临床获得性耐药的重要途径。

 

图4 细菌水平基因转移机制

(A) 接合作用：不同物种或同一物种的细菌可通过物理接触（如通过性菌毛或孔道结构）交换遗传物质。

(B) 转导作用：噬菌体作为染色体或胞外供体DNA的载体，在感染过程中不仅注入自身遗传物质，同时传递此前携带的供体DNA，使受体细胞获得包括抗生素耐药性在内的新性状。

(C) 转化作用：细菌直接摄取外源DNA，并将其整合至宿主基因组中的基因转移过程。

水平基因转移（HGT）由可移动遗传元件（MGEs）驱动，这些元件能够在细菌染色体内部或之间移动。微生物组中MGEs的集合被称为移动组。移动组包含若干高度异质的组分，它们均需要转座酶样介导基因切除。能够携带大片段遗传物质（约10kb至Mb级）的MGEs包括质粒、噬菌体和整合性接合元件（ICEs）。较小型的MGEs则包括插入序列、转座子和整合子（本身不可移动但可通过重组获得基因盒并调控其表达）。不论其分类如何，MGEs常与耐药临床分离株相关。2021年一项研究发现，在多种致病菌中，77%的接合质粒介导的耐药基因与插入序列存在关联。类似地，对铜绿假单胞菌基因组的调查显示，超过84%的菌株携带ICE，其中过半与AMR相关。MGEs在细菌基因组中普遍存在，主要负责耐药基因在微生物组内部及跨组间的流动，充当适应性、微生物进化乃至最终生存的媒介。

多个耐药基因在MGE中的捕获与存留可表现为多重耐药性（MDR）。具有此类特征的病原体是导致临床及社区抗生素治疗失败的主因；后者正成为产超广谱β-内酰胺酶（ESBL）肠杆菌科细菌日益增长的储库。COVID-19大流行与战争等社会动荡加剧了MDR感染的防治难度。部分细菌通过MGEs获得了惊人数量的耐药基因。例如，近期一份乌克兰伤兵病例报告鉴定出耐甲氧西林鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、屎肠球菌和铜绿假单胞菌，这些菌株对大多数现有抗生素耐药。其中肺炎克雷伯菌分离株对所有测试抗生素均耐药，基因组测序鉴定出24个独立耐药基因。最新研究显示，对源自MDR假单胞菌的巨型质粒（>420kb）进行分析，发现其富含MGEs并携带针对多种抗生素的耐药基因。对中国东部三甲医院临床分离株的调查发现，167份肺炎克雷伯菌分离株中57%携带1类整合子，共鉴定出169个耐药基因盒。

MGEs的多样性极为显著。一项2022年研究采用捕获载体策略检测一组MDR肠杆菌科分离株，发现每个菌株均含有多个插入序列、新型转座子以及新型转座子的形成。无疑，临床环境中存在丰富且不断演变的MGEs谱系，它们共同赋予细菌MDR表型。

MGEs加剧了AMR的One Health，耐药基因可在农场、环境或临床中被筛选出来，并通过微生物群体高效传播。人类与动物病原体及环境细菌易混合的生态位（如污水处理厂、水产养殖塘、饲养场和农场）常被抗生素残留污染，为耐药元件的筛选和细菌群落间的基因交换提供了独特条件。

食用动物中发现的首例抗生素耐药性于1951年报道，当时火鸡被喂食链霉素作为预防措施。这虽是牲畜中抗生素使用引发耐药的首个案例，却非最后一例；该实践至今仍很普遍，并助推耐药基因传播。一项针对家禽与屠宰场工人微生物组及耐药组关联的研究，在鸡与人类样本中共同鉴定出11个临床相关耐药元件，且这些基因具有可移动性。一名屠宰场工人和一名家庭成员携带了与鸡源相同的可移动ARGs。中国食品市场的零售猪肉中检出碳青霉烯耐药鼠伤寒沙门菌，证明食用动物可向人类传播耐药基因的风险。

人体微生物组也是抗生素耐药基因的储库。病原菌感染时可发生HGT事件，可能将抗生素耐药性转移给入侵病原体。肠道微生物群中已鉴定出对四环素类、大环内酯类和β-内酰胺类等多种抗生素的耐药基因。不仅肠道微生物组中存在耐药基因，HGT也频繁发生，尤其在中性粒细胞减少/免疫缺陷个体中更常见。虽然艰难梭菌中介导甲硝唑耐药的高拷贝质粒来源尚未确认，但厚壁菌门等近缘共生菌间的HGT事件可能是这一新兴耐药机制的根源。

人体微生物组与耐药组的建立是易受干扰的精细过程。早产儿作为最脆弱群体，其肠道微生物组相较于成人或健康婴儿更不成熟且缺乏微生物多样性。这些婴儿长期住院期间，微生物组的定植菌主要来自医院环境，因此可能存在MDR菌株的耐药基因转移。抗生素治疗不仅增加早产儿获得这些耐药基因的风险，同时会降低肠道微生物组多样性，为致病菌株的筛选创造机会。

降低早产儿获得独特耐药元件的策略之一是通过益生菌干预。Guitor等发现，未接受益生菌的早产儿体内存在80种独特抗生素耐药基因，而接受益生菌的早产儿及足月儿则显著减少。更重要的是，这些基因多数与MGEs相关联。其中部分介导氨基糖苷类和β-内酰胺类耐药的基因在未接受益生菌的婴儿出院后仍持续存在于肠道微生物组。尽管耐药基因无处不在，但通过益生菌治疗有望降低其多样性，为最脆弱的患者提供保护。

HGT与MGEs显著推动获得性抗生素耐药性的发展。理解耐药基因传播机制对于应对临床新兴耐药性至关重要。HGT存在于所有细菌群落中。鉴于不同微生物组间存在基因与微生物交换的潜力，耐药基因在环境、动物与人类间的流动是可预测的必然现象。然而，直接追踪单个耐药基因的起源，或精准预测基因交换路径与时间仍具挑战。持续深化对这一复杂过程的理解，对于可靠预测微生物群落中耐药性的演变轨迹与传播范围具有至关重要的意义。

缓解抗菌素耐药性

细菌在抗生素压力下的生存能力对现代医学构成了生存性威胁。它们为产生耐药性所部署的分子策略之多样，堪称非凡。鉴于耐药性的遗传多样性、高效介导细菌间基因交换的可移动遗传元件（MGEs）的影响，以及不同微生物组中庞大的细菌基因组数量，AMR的出现几乎不可避免，从而对我们管理传染病的能力构成持续不断的威胁。

传统上，缓解AMR影响的主要策略是研发新型抗生素以替代旧药。然而，这一方法已不复20世纪的辉煌——我们目前使用的大多数抗生素均发现于那个时期。其原因错综复杂，与新抗生素药物的经济回报率低密切相关。尽管如此，新型抗生素当下仍是必需，未来也将持续需要，即便噬菌体、治疗性抗体等并行策略正得到越来越多的探索。

COVID-19大流行向我们表明，新型疫苗技术能对控制新发传染病产生深远影响。预防感染通过减少抗生素的使用需求，对AMR也能产生积极影响。针对细菌毒素（如百日咳、破伤风和白喉）的疫苗已使用数十年。然而，针对特定致病菌的疫苗却远未普及。肺炎球菌感染疫苗的成功是一个显著的特例。但肺炎球菌疫苗也突显了一个重要问题：与抗生素类似，它们同样易受目标生物体遗传变异的影响。因此，疫苗技术必须持续更新——自20世纪80年代首次问世以来，肺炎球菌疫苗已追加了20多种血清型，而推动此类更新的经济激励却往往微乎其微。

包括免疫调节、抗体、疫苗、噬菌体等在内的新技术，能够减少对抗生素的需求，从而有助于缓解AMR危机。然而，在中短期内，抗生素很可能仍是控制细菌感染的基石。因此，主动预测并预防耐药性的出现至关重要。大规模实现这一目标的最佳途径是通过基因组测序及后续的耐药决定簇检测。从基因型出发，理论上可以预测相应的耐药表型（图5A）。但遗憾的是，在实践中，情况远非如此简单。

 

图5 应对抗菌素耐药性的人工智能策略

(A) 基于基因组测序数据预测AMR表型的标准分析流程：首先从细菌群体（单一分离株或宏基因组）中提取DNA，经测序和生物信息学处理获得组装基因组。通过比对参考数据库的生物信息学工具鉴定耐药决定因子，随后采用机器学习方法，根据特定AMR决定因子及其遗传背景的存在情况，预测对不同抗生素的AMR表型。其预测效能取决于训练数据的质量与规模以及模型架构的优化程度。

(B) 典型的人工智能抗生素研发流程：首先在已知抗生素化合物库上训练机器学习模型，随后利用该模型对扩展化合物库进行虚拟筛选，基于模型定义的结构与功能特征识别潜力抗生素候选物，最终通过体外和体内实验对预测阳性化合物进行生化验证。

 

近年来，基因组测序这一关键步骤已取得显著进步。以牛津纳米孔公司推出的单分子纳米孔测序技术为代表的长读长、高精度测序技术，有望推动测序技术的普及化。然而，目前对于临床常规的大规模基因组分析而言，成本在多数情况下依然过高，且全球许多地区，常常是抗菌素耐药性最为流行的区域，仍难以负担。尽管如此，这些技术能够实现高质量的基因组组装，这对于解析抗生素耐药基因的遗传背景、理解其调控机制与流动特性至关重要。

在全基因组测序数据中检测抗生素耐药决定因子面临若干挑战。首先，由于通常通过与参考数据库进行比对来识别，参考数据的质量必须达到最高标准。为此开发的CARD数据库旨在解决这一问题。CARD是一个经过人工严格审编的抗菌药耐药决定因子集合，其中每个因子均通过实验证实能够提高抗菌药的最低抑菌浓度。该数据库以抗生素耐药本体为核心构建，该本体是一个将抗生素耐药基因序列、突变及相关元数据关联起来的网络。CARD 3.2.9版本包含7,170个本体术语、5,194条参考序列、2,008个突变以及5,242个AMR检测模型。它还提供诸如耐药基因标识符（RGI）等工具，该工具利用预设的检测阈值，从基因组或宏基因组序列中识别已知的耐药决定因子。

然而，目前尚无有效的生物信息学方法，能够预测在数据库中无已知同源物的全新耐药决定因子。另一个AMR数据库ResFinder已转向功能宏基因组学以填补这一空白。通过分析功能宏基因组学研究的数据，Gschwind等人构建了ResFinderFG数据库，该数据库收录了3,913个环境抗菌药耐药基因。将该数据库用作参考时，能够检测到其他方法未能识别出的抗菌药耐药基因。此例证彰显了环境中耐药性的巨大多样性，以及功能宏基因组学等技术在耐药基因出现于临床或农业环境之前即将其识别的潜力。

Dahl等人采用参考序列引导的方法，利用空肠弯曲菌的全基因组预测耐药基因。空肠弯曲菌是一种广泛传播的食源性病原体，常导致人类肠胃炎。食用动物生产中抗生素的广泛使用，致使空肠弯曲菌对多种抗生素（包括用于治疗弯曲菌感染的重要临床药物）产生耐药性。通过对516个分离株进行分析，Dahl等人测定了其对六种不同抗生素的耐药表型，并与相关的耐药基因型进行比较。利用多种生物信息学工具（改良的KMA、ABRicate、ARIBA和ResFinder），发现七个耐药基因（tet(O)、tet(O/32/O)、aac(6')-Ia、aph(2'')-If、blaOXA、aph(3')-III和cat）与空肠弯曲菌的耐药谱相关。此外，还鉴定出三个基因（gyrA、23S rRNA和rpsL）的突变也可能导致AMR。该方法揭示，AMR遗传决定因子与耐药表型高度相关（>98%），为基因组测序预测AMR的潜力提供了一个令人鼓舞的范例。

尽管有这些积极的研究成果，预测AMR的最大挑战仍在于如何准确地将生物体的基因型与二元（耐药/敏感）或定量（MIC）表型相关联。虽然在许多情况下，关键AMR决定因子（如氨基糖苷类修饰酶或β-内酰胺酶）的单纯存在足以导致耐药，但大多数耐药决定因子的实际情况更为复杂。不同分类群乃至物种内部存在的固有和获得性耐药机制各异，使得这一问题进一步加剧。若一个生物体内存在多个潜在的耐药元件，预测其MIC尤其具有挑战性，同时基因及表达水平的差异也使预测更加困难。机器学习技术——即利用经过良好校准的数据训练模型以对新数据进行分类——正成为该领域的一项强大工具。Tsang等人发现，在将基因组分类为β-内酰胺耐药菌或敏感菌时，逻辑回归模型的表现优于基于规则的程式。这最终促使人们发现了已知β-内酰胺酶的新底物活性，表明机器学习具有阐明迄今未被察觉的新型耐药模式的潜力。

基于机器学习的方法存在一个局限性，即需要获取大量高质量数据来训练模型。从基因组数据预测抗菌药物敏感性，依赖于将完整的细菌基因组与可靠的抗菌药物敏感性谱进行匹配。目前，此类数据的最佳资源是病原系统资源整合中心（PATRIC），该中心现已纳入细菌与病毒生物信息资源中心（BV-BRC）网站下。这是一个在线平台，提供超过1,000,000个经RASTtk（基于子系统技术的快速注释工具包）统一注释的细菌基因组的公共访问权限。其中18%的基因组包含AMR表型信息。然而，这些表型数据中仅有64%经过实验室验证，其余为计算预测。此外，在含有AMR表型的基因组中，仅38%包含相关的MIC值。最后，确定这些基因组耐药表型的方法并不一致，所测试的分类群和药物组合亦然。这些不一致性导致在考虑如何最佳利用该数据训练关联AMR基因型与表型的预测模型时面临诸多障碍，并凸显了在该领域获取标准化数据的挑战。

除上述困难外，还存在可能影响模型性能的地理和时间差异。例如，基于某一国家大肠杆菌分离株基因组训练的模型，可能对来自另一地区的同一物种分离株预测效果不佳。同样，由于遗传背景和选择压力随时间推移发生变化，十年后对同一地点的分离株进行预测，模型性能也可能下降。因此，为基于机器学习的AMR谱预测进行数据生成，需要大量的投资和维护，方能对AMR预测产生显著影响。然而，通过应对这些挑战、利用所有可用数据源以及创建用于模型训练的标准化数据集，有望在不预先了解底层机制的情况下，准确预测AMR表型及相关基因型。

Davis等人开发了早期版本的机器学习预测模型，他们利用PATRIC数据集，开发了一种AdaBoost（自适应增强）模型来区分耐药生物与敏感生物的基因组。他们的方法包括首先将给定物种的基因组（具有经实验室验证的AMR表型）按对某种抗生素耐药或敏感进行分类。分类后，计算每个基因组中独特31-mer的k-mer计数。机器学习模型根据这些计数确定哪些k-mer与抗生素耐药性最相关。随后将这些k-mer用作新输入基因组的分类器，以预测其推定的AMR表型。采用该方法，他们以88%至99%的准确率识别了鲍曼不动杆菌的碳青霉烯耐药性、金黄色葡萄球菌的甲氧西林耐药性以及肺炎链球菌的β-内酰胺和复方新诺明耐药性。此外，他们还预测了结核分枝杆菌对异烟肼、卡那霉素、氧氟沙星、利福平和链霉素的耐药趋势，准确率介于71%至88%之间。该方法此后被应用于PATRIC数据库中的许多基因组，以得出耐药表型的计算预测。尽管前景广阔，但由于上述局限性，该方法可能并非对所有物种的所有抗生素都表现良好。因此，在解读这些计算预测结果时应保持谨慎。

机器学习预测模型正在不断改进，但其性能仍在很大程度上依赖于所采用的方法以及病原体/抗生素的组合。Hu等人发现，在78种物种-抗生素组合的表型预测中，Kover是四种机器学习模型中表现最佳的，尽管其预测准确性存在波动。对于那些与模型训练所用基因组差异极大的情况，传统的基于规则的表型预测其表现优于基于机器学习的模型。这表明基于规则的方法在未来几年内很可能继续发挥其辅助作用。

人工智能与深度学习的另一应用领域在于新型抗生素的发现（图5B）。该领域旨在将生物学知识、数据与先进的计算技术相融合，以期识别新型化合物、开发更快速的新技术，从而革新抗生素研发的格局。AI在从头设计抗生素发现中的应用，正被证明是该技术一个强大的新兴应用方向。

总结

抗生素古已有之，抗菌素耐药性（AMR）同样如此。耐药元件通过基因组复制在细菌群落中垂直分布，并借助可移动遗传元件（MGEs）实现水平转移，这一进化过程堪称微生物最具代表性的生存策略。通过MGEs实现的基因物质便捷交换，极大拓展了细菌的基因组多样性，使其能够适应各种环境和条件。这些元件也成为抗生素耐药基因传播的核心驱动力，其结果是AMR对当今所有类别的抗生素均构成威胁。

临床医师、政策制定者、制药及生物技术产业必须共同认清现实：AMR可能已成为当今医学与农业领域最紧迫的威胁。他们更需认识到，AMR是细菌不断进化、在菌群间持续传播的基本生存机制，并借助现代交通与互联经济体系实现全球快速扩散。因此，必须通过政策激励推动新型抗生素研发、抗生素替代方案探索及AMR检测技术创新。若应对不力，人类将面临传染病失控的困境，重归前抗生素时代的严峻现实。