空肠弯曲杆菌感染诱导禽宿主防御肽在体外和体内的动态表达

  一、 文章背景：

  HDP是动物先天免疫系统的重要效应分子。在鸟类物种中，β防御素和cathelicidins代表了HDP的两个主要家族。迄今为止，在鸡中共报告了14种禽β防御素(AvBD1-14)和4种cathelicidins(CATH1-3和CATHB1)。表达分析表明，广泛的细胞、组织和器官可以表达 AvBDs 和 cathelicidins。禽类HDP对许多病原体和免疫调节作用具有直接的抗菌活性，例如趋化性，免疫激活和炎症调节。研究表明，天然和重组HDP在体外对空肠弯曲菌具有抗菌活性和免疫调节作用。然而，关于鸡HDPs与鸡空肠弯曲菌定植的相互作用知之甚少。

  二、 文章方法：

  文章主要设计了两个实验：一是培养鸡巨噬细胞系HD11，然后外源添加空肠弯曲菌，孵化过夜后，提取细胞的RNA，并通过RT-qPCR验证细胞内免疫因子的表达水平。二是培养肉鸡，然后饲喂空肠弯曲菌，培养一段时间后进行屠杀，最后收集脾脏和盲肠扁桃体，并通过RT-qPCR验证细胞内免疫因子的表达水平。

  三、文章结果：

  1. 3.1. 禽类HDP在HD11细胞中的表达模式

  如图1所示，在14种AvBDs和4种cathelicidins中，AvBD1-2和CATH1-3高表达(Ct ≤ 20)，平均Ct值分别为19.0、18.7、18.8、18.8和19.1，与参考基因GAPDH(Ct = 19.1)相当。AvBD7(20.8)、AvBD4(22.1)、AvBD6(25.4)和AvBD5(26.9)以中等水平表达(20

  图 1.鸡巨噬细胞系HD11中禽类HDP的Ct值。采用qRT-PCR的Ct值评价HD14细胞中4种禽β防御素和11种儿茶素的表达水平。虚线表示参考基因GAPDH的平均Ct值。所有值均代表一式三份进行的三个独立实验。

  2. 空肠弯曲菌感染诱导禽 HDP 在 HD11 细胞中的表达

  在感染后0、5、2和8 h，通过qRT-PCR评估空肠弯曲菌感染诱导的HD24细胞中禽HDPs的表达。空肠弯曲菌感染和未感染对照HD14细胞之间2个AvBDs(图4A和B)和2个cathelicidins(图1C)的基因表达表现为倍数变化。有趣的是，未感染的HD1细胞中表达相对较高的AvBD2-1，CATH3-7，AvBD4，AvBD6和AvBD11(图1)，随着空肠弯曲菌的持续感染从0.5 h逐渐降低到24 h(图2)。相比之下，AvBD3、AvBD5、AvBD8-14和CATHB1在未感染的HD11细胞中表现出相对较低的表达水平(图1)，在空肠弯曲菌感染时显着增加表达(图2)。例如，与未感染的对照组相比，空肠弯曲菌感染的HD1细胞中CATHB11的表达在感染后1.1、8、7和110小时分别增加了约8.61、7.0、5.2和8.24倍(图2C)。

  图 2.HD11细胞中空肠弯曲菌感染的禽HDP的相对表达水平。在感染后0.5，2，8和24小时收集细胞。14种禽β防御素(A和B)和4种cathelicidins(C)的基因表达比较计算为空肠弯曲菌感染组相对于模拟组的倍数变化。虚线表示模拟组中鸟类HDP的相对表达。虚线上方的条形表示表达的上调，虚线下方的条形表示下调。条形上方的星号表示基因表达的统计学显着差异(P < 0.05)。数据代表一式三份进行的三个独立实验。

  3. 禽类HDPs在鸡脾脏和盲肠扁桃体中的表达模式

  收集1、3、15 DPI安乐死未感染对照鸡的脾脏和盲肠扁桃体，采用qRT-PCR评价禽HDPs在鸡免疫器官中的表达模式。对于鸡脾脏或盲肠扁桃体，在1、3和15 DPI下收集的样品之间的HDP表达没有显着差异。因此，将不同日期收集的每种组织的所有样品一起计数，以评估禽HDP的表达水平。如图3所示，12种AvBDs和4种儿茶苷在脾脏和盲肠扁桃体之间的表达模式相似。脾脏和盲肠扁桃体AvBD1-2、7-8和12-13的平均Ct值在26.3-29.9之间，而AvBD3-6、9、14、CATH1-3和CATHB1的平均Ct值均大于30。盲肠扁桃体AvBD10和AvBD11的平均Ct值分别为26.3和27.9，脾脏的平均Ct值分别为31.4和30.2，差异有统计学意义。

  图 3.禽类HDP在鸡脾和盲肠扁桃体中的Ct值。采用qRT-PCR的Ct值评价鸡脾脏(A)和盲肠扁桃体(B)中14种禽β防御素和4种儿茶素的表达水平。虚线表示参考基因GAPDH的平均Ct值。数据表示在不同时间点安乐死的模拟组鸡± SEM 的手段。

  4. 空肠弯曲菌感染诱导禽类HDPs在鸡脾脏和盲肠扁桃体中的表达

  采用鸡挑战实验评估空肠弯曲菌感染诱导的禽类HDPs表达情况。当接种到鸡中时，空肠弯曲菌NCTC 11168早在5 DPI时就定植了所有1只鸡，水平为105盲肠内容物的CFU/g(图4)。从3-15 DPI，定植逐渐达到108盲肠内容物的CFU/g(图4)。

  图 4.空肠弯曲杆菌在鸡中的定植。用空肠弯曲菌NCTC 11168(104每只鸡的CFU)。安乐死鸡的盲肠含量分别用于接种后第1、3、6、10和15天空肠弯曲菌的CFU计数。虚线表示检测限制。星号表示与 P < 0.05 显著不同。

  收集鸡脾脏和盲肠扁桃体，评价空肠弯曲菌感染诱导的禽HDPs在早期、中期和晚期(1、3和15 DPI)的表达。14种AvBDs(图5 A和B)和4种cathelicidins(图5C)在鸡脾脏中的比较基因表达表现为空肠弯曲菌感染组相对于模拟组的倍数变化。只有AvBD14表达在3 DPI时显示出显着上调(0.1倍)。在3 DPI时，大多数鸟类HDP的表达，包括AvBD1-4，AvBD6-7和CATH1-3显着上调，范围从3.1到13.9倍。然而，空肠弯曲菌感染组中大多数禽类HDP的表达降低到与模拟组相当的水平，为15 DPI。例外地，在AvBD9(15.8倍)，AvBD10(16.5倍)，AvBD12(4.6倍)和CATH2(10.5倍)中观察到显着上调的表达。

  图 6.禽类HDP响应鸡盲肠扁桃体空肠弯曲菌感染的相对表达水平。在感染后第1、3和15天从每只鸡身上收集蝾体扁桃体。将14种禽β防御素(A和B)和4种cathelicidins(C)的基因表达计算为空肠弯曲菌感染组相对于模拟组的倍数变化。虚线表示模拟组中鸟类HDP的相对表达。虚线上方的条形表示表达的上调，虚线下方的条形表示下调。条形上方的星号表示与模拟组有统计学意义的差异(P < 0.05)

  四、文章总结：

  综上所述，空肠弯曲菌感染可诱导禽类HDP在体外和体内的动态和多样化表达。在HD11巨噬细胞中，空肠弯曲菌感染抑制了相对较高的HDP表达，但促进了较低表达的HDP。 在空肠弯曲菌感染鸡中，大多数禽类HDP在脾脏中表现出动态倒V表达模式。与脾脏相比，空肠弯曲菌感染鸡盲肠扁桃体中禽类HDP的表达受到抑制。需要进一步的研究来揭示鸟类HDP在鸡中空肠弯曲菌定植中的作用和机制。

  参考文献：Li P, Cui Y, Guo F, Guo J, Cao X, Lin J, Ding B, Xu F. Campylobacter jejuni infection induces dynamic expression of avian host defense peptides in vitro and in vivo. Vet Microbiol. 2023 Feb;277:109631. doi: 10.1016/j.vetmic.2022.109631. Epub 2022 Dec 9. PMID: 36543091.