婴儿配方奶粉的"守护神"：三种噬菌体联手狙击坂崎克罗诺杆菌

"隐形杀手"——坂崎克罗诺杆菌如何威胁新生儿健康

坂崎克罗诺杆菌是肠杆菌科细菌，近年被确认为新兴食源性病原体。该菌与新生儿食用受污染配方奶粉后的严重感染密切相关，临床表现包括脑膜炎、菌血症和坏死性小肠结肠炎，病死率高达40%-80%，幸存者常遗留神经系统和发育障碍。

婴儿配方奶粉并非无菌产品，生产过程中添加的非热处理的植物源性成分可能引入污染。此外，加工设备、冲调器具的交叉污染以及冲调后的不当储存均可导致细菌滋生。坂崎克罗诺杆菌具有耐干燥、较宽温度生长范围、热耐受性和生物膜形成能力，使其能在奶粉加工环境中长期存活并持续污染。

国际食品微生物规范委员会将坂崎克罗诺杆菌列为"对特定人群具有严重危害、可危及生命或导致严重慢性后遗症"的病原体，与肉毒梭菌和李斯特菌属于同一风险等级。

三种噬菌体的发现

噬菌体是自然界中专门感染细菌的病毒，被称为细菌的"天敌"。它们无处不在——土壤里、河水里、甚至人体肠道里都有它们的身影。它们对人体完全无害，但对特定的细菌却有着精准的杀灭能力。

研究人员将粪浆带回实验室，加入坂崎克罗诺杆菌作为"诱饵"进行培养。如果粪浆里有能感染这种细菌的噬菌体，它们就会大量繁殖。第二天，他们将样本过滤，滴在涂满细菌的培养皿上。培养皿上出现了几个透明的小圆点——那是细菌被裂解后留下的空斑，证明噬菌体存在。

就这样，他们从粪浆中成功分离出三种不同的噬菌体，分别命名为IeB、IeE和IeN。

用电子显微镜观察，三种噬菌体都长着中等大小的头部和可以收缩的尾巴，头部直径约110-120纳米，尾部长约115纳米。这种形态特征表明它们属于肌尾噬菌体科，是T4噬菌体家族的成员。

接下来是对三种噬菌体进行"基因体检"。全基因组测序显示，IeB、IeE和IeN的基因组大小分别为177,907、179,516和181,570个碱基对，GC含量均为45%。三种噬菌体的基因组高度相似，与T4噬菌体也有很强的同源性。

最关键的是安全性检测：三种噬菌体的基因组中都没有发现溶原性相关基因，也没有检测到毒素基因。这意味着它们都是裂解性噬菌体——目标就是杀死细菌，而不会把自己的基因整合到细菌基因组中，更不会给细菌传递有害基因，这为后续的食品应用奠定了基础。

单兵作战不如组团出击——为什么要用噬菌体鸡尾酒

有了这三种噬菌体，研究团队开始测试它们的"战斗力"。

他们用21株不同的克罗诺杆菌（包括从临床病例中分离的菌株）进行宿主范围测试。结果显示：IeB能感染12株，IeE能感染12株，IeN能感染13株

三种噬菌体还能跨种作战——不仅能感染坂崎克罗诺杆菌，还能感染克罗诺杆菌属的其他菌种，以及阴沟肠杆菌等。但单一噬菌体总有覆盖不到的菌株。于是，研究人员将三种噬菌体等比例混合，制成"鸡尾酒"制剂。这一招效果显著：三种噬菌体联手，对测试菌株的覆盖率达到73%。为什么要用鸡尾酒而不是单一种？这好比作战，单兵总有打不过的敌人，但多兵种协同作战，胜算就大得多。而且，如果只用一种噬菌体，细菌可能很快产生抗性；三种一起上，细菌几乎无处可逃。

温度稳定性测试：将噬菌体在不同温度下处理1小时，然后检测活性。结果显示，三种噬菌体在4°C至50°C范围内都能保持感染活性，最适温度为4-37°C。60°C以上处理1小时后，未检测到存活噬菌体。

pH稳定性测试：将噬菌体在不同pH环境中处理1小时。结果显示，在pH 6-10范围内，三种噬菌体都能保持活性。pH 4以下处理1小时后，未检测到存活噬菌体。

这些结果意味着什么？婴儿奶粉冲调用水通常不超过50°C，pH接近中性，完全在噬菌体的稳定范围内，这说明这三种噬菌体在实际应用中是可行的。

实战检验——噬菌体鸡尾酒在奶粉中的杀菌效果

准备工作就绪，现在是最关键的环节：噬菌体鸡尾酒在真正的婴儿奶粉中表现如何？

研究人员从超市购买了四种不同品牌的婴儿配方奶粉，按常规方法冲调。他们在奶粉中加入坂崎克罗诺杆菌，起始菌量控制在约1万CFU/mL。这个浓度远高于实际污染水平——奶粉中通常每100克都检不出1个细菌。研究人员故意用这么高的浓度，就是为了检验噬菌体的极限杀灭能力。

随后，他们在部分样品中加入噬菌体鸡尾酒（浓度约3*107 pfu/mL），另一部分不加作为对照。所有样品在37°C下培养，每2小时取样计数，持续20小时。

结果令人振奋：

对照组：细菌疯狂生长，20小时后数量超过107 CFU/mL

噬菌体组：处理5小时后，细菌数量就降至检测限以下（<10 CFU/mL），并在整个20小时监测期内一直保持这个水平

为了更直观地验证效果，研究人员还使用了一种发光细菌株——这种菌被改造后，活着的时候会发光。将发光菌加入奶粉，一半加噬菌体，一半不加，用活体成像系统监测。

结果清晰可见：加噬菌体的样品始终漆黑一片（细菌死亡），不加噬菌体的样品亮度持续增强（细菌繁殖）。终点平板计数证实，噬菌体处理组菌量<10 CFU/mL，对照组菌量达107 CFU/mL。

这意味着，即使奶粉被污染，只要在冲调后加入噬菌体鸡尾酒，就能在5小时内将病原菌彻底清除，并保持一整天无菌状态。

防患于未然——噬菌体如何阻止细菌"安家"

杀灭水中的细菌只是第一步。前面提到，坂崎克罗诺杆菌还有一个更棘手的问题——它能在奶瓶、奶嘴、喂养管等表面形成生物膜。一旦生物膜形成，就会成为反复污染的源头，常规清洗很难彻底清除。

那么，噬菌体鸡尾酒能预防生物膜形成吗？

研究人员首先筛选了5株克罗诺杆菌在婴儿奶粉中的生物膜形成能力。结果发现，C. sakazakii ATCC BAA 894和C. sakazakii DPC 6528这两株菌，在四种不同品牌的奶粉中都能形成致密的生物膜。接下来，他们在微孔板中进行预防实验：将这两株菌加入奶粉，一半加噬菌体鸡尾酒，一半不加，培养48小时后用结晶紫染色检测生物膜，结果差异显著：

对照组：孔壁出现明显的紫色环状染色，表明形成了厚厚的生物膜

噬菌体组：孔壁几乎无色，表明没有生物膜形成

将结晶紫溶解后测定吸光度，噬菌体处理组显著低于对照组。活菌计数显示，噬菌体处理组孔内细菌数量已降至检测限以下（<10 CFU/mL），而对照组仍高达107CFU/mL。这表明，噬菌体鸡尾酒不仅能杀灭水中的浮游细菌，还能完全阻断生物膜的建立。如果在冲调奶粉时加入噬菌体，或用噬菌体溶液清洗奶瓶奶嘴，就能从源头上切断持续污染的链条。

为新生儿筑起防线，或许就从这三株小小的噬菌体开始。 

原文出处：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S016816051730168X