本研究首次获得了一个广谱识别多种沙门氏菌血清群的纳米抗体 Nb-01 和四个鼠伤寒沙门氏菌特异性纳米抗体，并基于此构建了一种新型链霉亲和素桥接增强型夹心 ELISA 方法。该方法利用链霉亲和素定向固定生物素化纳米抗体作为捕获抗体，以噬菌体展示的纳米抗体作为检测抗体，实现了对鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、伦敦沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌和哈达尔沙门氏菌等五种常见血清群的同时检测灵敏度较传统被动吸附法提高约 6 倍。本研究为食源性致病菌的多重检测提供了高灵敏度、高特异性的新策略，在食品安全监测领域具有广阔的应用前景。

沙门氏菌是引起人类食源性疾病的主要病原菌之一，全球已鉴定出超过 2500 种血清型，其中约 95% 的沙门氏菌感染与受污染食品的摄入有关。不同血清型具有不同的感染剂量和致病性，因此实现对多种沙门氏菌血清型的同步检测对于食品安全监测具有重要意义。传统的基于单克隆抗体或多克隆抗体的免疫检测方法存在筛选周期长、成本高、特异性有限等局限。纳米抗体作为源自骆驼科动物重链抗体的可变区，具有分子量小、稳定性高、易于基因工程改造等独特优势，为开发新型免疫检测方法提供了理想识别元件。该研究从免疫噬菌体展示纳米抗体库中筛选获得广谱沙门氏菌纳米抗体和特异性纳米抗体，并利用链霉亲和素-生物素系统构建了高性能的夹心 ELISA 检测平台。

广谱与特异性纳米抗体的筛选与鉴定

研究人员以热灭活的鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌为免疫原，构建了容量为 1 × 10⁷ 的噬菌体展示纳米抗体库。经过三轮亲和筛选，从 48 个随机克隆中鉴定出 5 个阳性克隆，分别命名为 Nb-01、Nb-03、Nb-05、Nb-09 和 Nb-15。特异性分析表明，Nb-01 能够同时识别鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、伦敦沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌和哈达尔沙门氏菌等五种血清型，而对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌 O157:H7、单核细胞增生李斯特菌等非沙门氏菌食源性病原体无交叉反应，表现出优异的广谱识别特性。进一步研究发现，Nb-01 的识别靶点为沙门氏菌脂多糖上保守的共同表位（α-GlcNAc-1→2-αGlc），这解释了其广谱识别机制。与之相对，Nb-03、Nb-05、Nb-09 和 Nb-15 仅特异性识别鼠伤寒沙门氏菌，其中 Nb-03 和 Nb-05 表现出优异的热稳定性，在 80°C 处理 10 分钟后仍保持 80% 以上的结合活性。

链霉亲和素桥接增强型夹心 ELISA 方法的建立

为克服纳米抗体因分子量小、随机物理吸附导致抗原结合位点被遮挡的问题，研究者开发了基于链霉亲和素-生物素系统的定向固定策略。将 Nb-01 基因亚克隆至 pINQ-BtH6 载体，在大肠杆菌中实现体内位点特异性生物素化，获得生物素化纳米抗体 BiNb-01。检测时，先将链霉亲和素包被于微孔板，通过其与生物素的高亲和力结合定向固定 BiNb-01，使抗原结合位点充分暴露于溶液相。同时，采用噬菌体展示的 Nb-01 作为检测抗体，利用噬菌体表面展示的 3-5 个纳米抗体拷贝数及抗 M13 抗体-辣根过氧化物酶的多重信号放大效应，显著提高检测灵敏度。

图一（a）抗沙门氏菌纳米体生物淘选的工作流程和沙门氏菌检测的SAB-ELISA平台。（b）制备BiNb的简要程序。

方法性能评估与实际样品应用

经优化，该方法的最佳条件为：链霉亲和素包被浓度 2.5 μg/mL，生物素化纳米抗体浓度 1.25 μg/mL，噬菌体展示纳米抗体浓度 8 × 10⁹ PFU/mL，封闭液采用无生物素的 Starting BlockTM 封闭缓冲液。在最优条件下，SAB-ELISA 对五种沙门氏菌血清型的检测限分别为：鼠伤寒沙门氏菌 6.31 × 10³ CFU/mL、肠炎沙门氏菌 9.15 × 10³ CFU/mL、伦敦沙门氏菌 4.23 × 10³ CFU/mL、乙型副伤寒沙门氏菌 7.31 × 10³ CFU/mL、哈达尔沙门氏菌 7.25 × 10³ CFU/mL。与采用纳米抗体被动吸附的传统夹心 ELISA 相比，该方法的灵敏度提高了约 6 倍。

在实际样品应用方面，研究者将不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌（10⁶、10⁷、10⁸ CFU/mL）加标至牛奶、蜂蜜、生菜和猪肉样品中进行回收实验。结果显示，回收率范围为 86.9% 至 106.6%，日内精密度和日间精密度均低于 6.3%，表明该方法在实际食品基质中具有良好的准确性和可靠性。

方法优势与应用前景

与传统基于单克隆抗体或多克隆抗体的沙门氏菌免疫检测方法相比，本研究开发的 SAB-ELISA 方法具有以下优势：一是纳米抗体可通过微生物发酵大量生产，成本低廉；二是链霉亲和素介导的定向固定策略有效解决了纳米抗体随机吸附导致的活性损失问题；三是噬菌体展示纳米抗体兼具识别和信号放大双重功能，无需额外标记步骤；四是广谱纳米抗体 Nb-01 可实现五种沙门氏菌血清群的同时检测，大幅提高了检测通量。该方法的检测灵敏度与近年来报道的基于表面等离子体共振、免疫层析等技术的沙门氏菌检测方法相比具有竞争力，为食源性致病菌的多重监测提供了新的技术手段，在食品安全快速检测领域具有良好的推广应用前景。

文献链接：https://doi.org/10.1016/j.aca.2022.339705